一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试剂盒的制备方法及试剂盒

1.本发明涉及试剂盒技术领域，尤其涉及一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试剂盒的制备方法及利用该制备方法制备得到的试剂盒。


背景技术：

2.鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium，s.typhimurium)是一种常见的食源性致病菌，可导致食源性疾病爆发。鼠伤寒沙门氏菌通常通过动物粪便污染食品，如牛奶、鸡蛋、果蔬和肉类等。鼠伤寒沙门氏菌感染可引起典型的食物中毒的症状，如腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发热和其他胃肠道症状。据报道，鼠伤寒沙门氏菌引起的食物中毒事件仍然呈上升的趋势。目前，该菌是鸡蛋、肉类和牛奶等农副产品的必检致病菌。
3.传统的鼠伤寒沙门氏菌检测方法包括平板培养法、酶联免疫吸附法(elisa)和聚合酶链式反应技术(pcr)。虽然这些技术已成为金标准或推荐的检测方法，但为了满足鼠伤寒沙门氏菌现场检测的需要，还需要构建更方便、易于操作和结果易读取的检测方法。在过去的几年中，各种新型生物传感器得到了广泛的发展，如比色传感器、荧光传感器、表面增强拉曼散射法(sers)和电化学生物传感器。它们具有反应迅速、使用方便、成本低、灵敏度好和选择性好等优点。其中，荧光传感器具有检测灵敏和荧光信号不易受影响的优势，利用便携式光学测量设备通过荧光颜色变化来检测被分析物。此外，与智能手机的图像获取和图像分析系统相结合，可以提供定性和半定量分析服务。


技术实现要素：

4.有鉴于此，为了满足鼠伤寒沙门氏菌现场检测的需要，一方面，本发明提供了一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试剂盒的制备方法，其通过先制备具有超顺磁性的磁珠，将磁珠作为磁性内核，包被上有机共价骨架(cof)形成核壳结构即mcof纳米磁性粒子，再利用原位还原法将金纳米粒子负载在mcof纳米磁性粒子上，最后与鼠伤寒沙门氏菌的适配体偶联合成具有高发射荧光的纳米探针apt-mcof-aunps。将鼠伤寒沙门氏菌与纳米探针共孵育形成探针-菌体复合物，加入淬灭剂fe
3+
进行淬灭探针荧光，由于菌体对纳米探针的保护作用和与fe
3+
的竞争性结合，探针的荧光不会被fe
3+
淬灭，在365nm紫外光照射下，溶液呈明亮的绿色荧光。从而实现鼠伤寒沙门氏菌快速和特异性检测。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
6.一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
7.步骤一：制备具有超顺磁性的fe3o4纳米粒子；
8.步骤二：磁性有机骨架mcof的制备
9.将步骤一制备的fe3o4纳米粒子作为磁性内核，包被上有机共价骨架(cof)形成核壳结构，得到mcof磁性纳米粒子；
10.步骤三：mcof-aunps纳米复合材料的制备
11.将金纳米粒子负载在步骤二制备的mcof磁性纳米粒子上，得到mcof-aunps纳米复
合材料；
12.步骤四：apt-mcof-aunps纳米探针的制备
13.将步骤三得到的mcof-aunps纳米复合材料与鼠伤寒沙门氏菌的适配体偶联合成具有高发射荧光的纳米探针apt-mcof-aunps；
14.步骤五：制备fe
3+
淬灭剂密封避光保存备用。
15.优选地，具体步骤如下：
16.步骤一：fe3o4纳米粒子的制备
17.将fecl3·
6h2o、ch3coona
·
3h2o在乙二醇中室温磁搅拌至完全溶解，然后将所得均质溶液转移至反应釜内,将反应釜放置于烘箱中反应，用永磁铁从反应溶液中分离黑褐色的固体物质，清洗后得到具有超顺磁性的fe3o4纳米粒子；
18.步骤二：磁性有机骨架mcof的制备
19.将1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛溶于1,4-二氧六烷和正丁醇中，充分溶解后，加入步骤一制备的fe3o4纳米粒子分散其中，加入醋酸进行反应，用永磁铁从反应溶液中分离褐色的固体物质，清洗后得到mcof磁性纳米粒子；
20.步骤三：mcof-aunps纳米复合材料的制备
21.将三水合氯金酸溶液加入到步骤二得到的mcof磁性纳米粒子，完全混匀后，加入柠檬酸三钠溶液反应，用永磁铁从反应溶液中分离褐色的固体物质，清洗后得到mcof-aunps纳米复合材料；
22.步骤四：apt-mcof-aunps纳米探针的制备
23.将三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液加入到沙门氏菌适配体水溶液，室温条件下混旋，得到活化后的适配体溶液，将步骤三得到的mcof-aunps纳米复合材料加入上述活化后的适配体溶液，室温条件下混旋过夜，得到apt-mcof-aunps纳米探针；
24.步骤五：淬灭剂的制备
25.取fecl3·
6h2o加至双蒸水中，混合均匀，得到fe
3+
淬灭剂，密封避光保存备用。
26.优选地，步骤一中，fecl3·
6h2o和ch3coona
·
3h2o质量比为1.2-3:3.2-8。
27.优选地，步骤二中，1,3,5-三(4-氨苯基)苯、2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛、fe3o4纳米粒子的质量比为102-106：86-88：115-120。
28.优选地，步骤二中，1,4-二氧六烷和正丁醇的体积比为0.8-1:1-1.2。
29.优选地，步骤三中，水合氯金酸溶液的浓度为1-1.2mm，柠檬酸三钠溶液的浓度为100-120mm。
30.优选地，步骤三中，三水合氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液、mcof纳米粒子的体积质量比为35-40ml：1.5-1.6ml：30-32mg。
31.优选地，步骤四中，沙门氏菌适配体水溶液的体积μl：mcof-aunps纳米复合材料的质量mg为9-10：0.18-0.2。
32.优选地，步骤五中，双蒸水的体积ml：fecl3·
6h2o的质量mg为95-100：25-27。
33.另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，采用上述制备方法制备得到。
34.本发明相对于现有技术，具有如下的有益效果：
35.本发明提供的检测鼠伤寒沙门氏菌的试剂盒的制备方法，通过先制备具有超顺磁性的磁珠，将磁珠作为磁性内核，包被上有机共价骨架(cof)形成核壳结构即mcof纳米磁性
粒子，再利用原位还原法将金纳米粒子负载在mcof纳米磁性粒子上，最后与鼠伤寒沙门氏菌的适配体偶联合成具有高发射荧光的纳米探针apt-mcof-aunps。将鼠伤寒沙门氏菌与纳米探针共孵育形成探针-菌体复合物，加入淬灭剂fe
3+
进行淬灭探针荧光，由于菌体对纳米探针的保护作用和与fe
3+
的竞争性结合，探针的荧光不会被fe
3+
淬灭，在365nm紫外光照射下，溶液呈明亮的绿色荧光。从而实现鼠伤寒沙门氏菌快速和特异性检测。
36.本发明利用纳米复合材料apt-mcof-aunps对鼠伤寒沙门氏菌检测,利用淬灭抑制作用实现荧光检测,缩短了检测时间,定量检测时变异系数小，最低检测浓度为4cfu/ml，模拟样回收率在97.38％-104.56％，灵敏度高，稳定性好，并且具有一定的适用性。结合智能手机色彩分析app(例如，colorcoll)实现图像分析获取半定量检测结果。
附图说明
37.图1为沙门氏菌检测标准曲线图；
38.图2为本发提供的apt-mcof-aunps检测鼠伤寒沙门氏菌流程图。
具体实施方式
39.本发明提供了一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
40.步骤一：制备具有超顺磁性的fe3o4纳米粒子，优选采用如下的制备方法制备得到：
41.优选将质量比为1.35：3.6的fecl3·
6h2o和ch3coona
·
3h2o在乙二醇中室温磁搅拌至完全溶解，然后将所得均质溶液转移至反应釜中,优选在200℃烘箱中反应16h；用永磁铁从反应溶液中分离黑褐色的固体物质，用超纯水和无水乙醇交替清洗3-5次，得到具有超顺磁性的fe3o4纳米粒子；
42.步骤二：磁性有机骨架mcof的制备
43.将步骤一制备的fe3o4纳米粒子作为磁性内核，包被上有机共价骨架(cof)形成核壳结构，得到mcof磁性纳米粒子，其优选的制备方法如下：
44.将1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛溶于1,4-二氧六烷和正丁醇中，充分溶解后，加入步骤一制备的fe3o4纳米粒子分散其中，加入醋酸，优选在70℃条件下搅拌48h，用永磁铁从反应溶液中分离绿色的固体物质，用丙酮和四氢呋喃交替多次洗涤mcof磁性纳米粒子，以去除未反应的物质，最后烘干，得到fe3o4@ag磁性纳米粒子，4℃避光保存备用；
45.其中，1,3,5-三(4-氨苯基)苯、2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛、fe3o4纳米粒子的质量比优选为105.4：87.4：120；
46.其中，1,4-二氧六烷和正丁醇的体积比优选为1:1；
47.步骤三：mcof-aunps纳米复合材料的制备
48.将金纳米粒子负载在步骤二制备的mcof磁性纳米粒子上，得到mcof-aunps纳米复合材料，其优选的制备方法如下：
49.将三水合氯金酸溶液溶液加入到步骤二得到的mcof，完全混匀后，加入柠檬酸三钠溶液，优选在20℃条件下搅拌反应40min。用永磁铁从反应溶液中分离褐色的固体物质，用双蒸水多次洗涤mcof-aunps纳米复合材料，以去除未反应的物质，最后烘干，得到mcof-aunps纳米复合材料，于4℃避光保存备用；
50.三水合氯金酸溶液溶液的浓度优选为1mm，柠檬酸三钠溶液的浓度优选为100mm；三水合氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液、mcof纳米粒子的体积质量比优选为40ml：1.6ml：32mg；
51.步骤四：apt-mcof-aunps纳米探针的制备
52.将步骤三得到的mcof-aunps纳米复合材料与鼠伤寒沙门氏菌的适配体偶联合成具有高发射荧光的纳米探针apt-mcof-aunps，其优选的制备方法如下：
53.将三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液加入到沙门氏菌适配体水溶液，室温条件下混旋，混旋时间优选为1h，活化适配体上修饰的巯基，得到活化后的适配体溶液，取mcof-aunps纳米复合材料，优选先用蒸馏水洗涤2次，用蒸馏水重悬，加入活化后的适配体，室温条件下混旋过夜，磁分离，去上清，蒸馏水洗涤三次，得到apt-mcof-aunps，于4℃避光保存备用；
54.其中，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液的浓度优选为1mm，沙门氏菌适配体水溶液的浓度优选为10μm，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液和沙门氏菌适配体水溶液的体积比优选为1：10，沙门氏菌适配体水溶液的体积μl：mcof-aunps纳米粒子的的质量mg优选为10：0.2；
55.其中，apt-mcof-aunps纳米探针尺寸优选为300nm；
56.本发明提供的抗沙门氏菌适配体序列为：5
′‑
sh-(ch2)
6-tat ggc ggc gtc acc cga cgg gga ctt gac ctt gacattatgaca g-3
′
，由上海生工生物公司合成；
57.步骤五：制备fe
3+
淬灭剂密封避光保存备用，其优选的制备方法如下：
58.取fecl3·
6h2o加至双蒸水中，混合均匀，得到fe
3+
淬灭剂，密封避光保存备用。
59.其中，双蒸水体积ml：fecl3·
6h2o质量mg为100：27。
60.下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚详细的解释。
61.实施例1
62.步骤一：制备具有超顺磁性的fe3o4纳米粒子
63.首先采用水热法制备fe3o4，取1.35g fecl3·
6h2o和3.6g ch3coona
·
3h2o在40ml乙二醇中室温磁搅拌至完全溶解。然后将所得均质溶液转移至反应釜中,于200℃烘箱中反应16h；用永磁铁从反应溶液中分离黑褐色的固体物质，用超纯水和无水乙醇交替清洗3次，得到具有超顺磁性的fe3o4纳米粒子；
64.步骤二：磁性有机骨架mcof的制备
65.制备mcof过程：将105.4mg的1,3,5-三(4-氨苯基)苯和87.4mg的2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛溶于含有20ml 1,4-二氧六烷和20ml正丁醇的混合溶液中，充分溶解后，加入制备的120mg fe3o4纳米粒子分散其中，加入0.5ml 12m醋酸，优选在70℃条件下静置48h，用永磁铁从反应溶液中分离绿色的固体物质，用丙酮和四氢呋喃交替多次洗涤mcof磁性纳米粒子，以去除未反应的物质，最后烘干；
66.步骤三：mcof-aunps纳米复合材料的制备
67.采用原位还原法制备mcof-aunps，将32mg的mcof加至40ml 1mm的haucl4溶液，完全溶解，加入1.6ml 100mm的柠檬酸三钠溶液，在20℃条件下搅拌反应40min。用永磁铁从反应溶液中分离褐色的固体物质，用双蒸水多次洗涤mcof-aunps纳米复合材料，以去除未反应的物质，最后烘干，得到mcof-aunps纳米复合材料,于4℃避光保存备用；
68.步骤四：apt-mcof-aunps纳米探针的制备
69.取1μl的1mm的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液加入到10μl的10μm沙门氏菌适配体水溶液，室温条件下混旋1h，活化适配体上修饰的巯基，取0.2mg的mcof-aunps纳米复合材料，用蒸馏水洗涤2次，用1ml蒸馏水重悬，加入活化后的适配体，室温条件下混旋过夜。磁分离，去上清，蒸馏水洗涤三次，得到apt-mcof-aunps纳米探针，4℃避光保存备用，这里使用的沙门氏菌的适配体序列为：5
′‑
sh-(ch2)
6-tat ggc ggc gtc acc cga cgg gga ctt gac ctt gacattatgaca g-3
′
，由上海生工生物公司合成。
70.步骤五：淬灭剂(fe
3+
标准溶液)的制备
71.称取27mg fecl3·
6h2o，溶于100ml双蒸水中，得到fe
3+
淬灭剂，密封避光保存备用。
72.实例2-4的制备方法同实施例1，其参数配置如下表1
73.表1实施例2-4的参数配置
[0074][0075]
[0076]
采用如下的方法对上述实施例1-4制备的试剂盒进行测试。
[0077]
菌液标准品的制备
[0078]
取-80℃保存菌种，进行菌株活化，将活化后的菌株在3％氯化钠胰蛋白脉琼脂平板上划线分纯，37℃培养18-24h后，挑取单个菌落，接种3％氯化钠胰蛋白胨液体培养基，37℃振荡培养12-18h。取1ml菌液10倍倍比稀释平板倾注法进行活菌计数。剩余的菌液用1％甲醛在室温下灭活10min，将灭活的菌液3000rpm离心3min，收集菌体，然后用pbs溶液充分混匀，制成菌悬液并用pbs溶液调节菌悬液浓度为109cfu
·
ml-1
，存于4℃冰箱中备用。
[0079]
基于apt-mcof-aunps与淬灭剂检测鼠伤寒沙门氏菌的方法
[0080]
检测流程如图2，分别取待测样品800μl和实施例1-4的200μl 2mg/ml的apt-mcof-aunps进行测试，室温避光混旋30min。加入200μl 1mm的fe
3+
，反应3min。在暗室中用365nm紫外光照射，智能手机拍照，用色彩分析app进行hsv分析，输出hue(色调，h)，saturation(饱和度，s)和value(明度，v)三个通道值，以色调值(hue value)作为鼠伤寒沙门氏菌浓度的输出定量信号。参考图1所作的标准曲线，确定样品中鼠伤寒沙门氏菌的数量。定量检测该菌的浓度范围在10-107cfu/ml。
[0081]
图1为上述沙门氏菌检测标准曲线图，其中横坐标为鼠伤寒沙门氏菌的浓度对数值，纵坐标为色调值。检测浓度范围：10-107cfu/ml。
[0082]
本发明方法检测稳定，检测限可低至4cfu/ml，检测时间短，操作简单，检测效果好。对鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌o157:h7等进行检测，实施例1-4中只有沙门氏菌的检测结果呈阳性，其余均为阴性，该方法特异性强，未见假阳性和假阴性结果，结果如表2-5。
[0083]
表2实施例1对沙门氏菌的特异性检测结果
[0084][0085]
表3实施例2对沙门氏菌的特异性检测结果
[0086]
[0087][0088]
表4实施例3对沙门氏菌的特异性检测结果
[0089][0090]
表5实施例4对沙门氏菌的特异性检测结果
[0091][0092]
注：《+》表示鼠伤寒沙门氏菌阳性，《-》表示鼠伤寒沙门氏菌阴性。
[0093]
模拟样品的检测
[0094]
将0.5g鸡肉研磨碎，与50ml无菌pbs混合形成匀浆。1毫升牛奶和蛋液用无菌的pbs稀释100倍，用0.22μm滤膜对滤出液进行抽滤。然后，在每个实际样本中接种鼠伤寒沙门氏菌进行培养，稀释后进行平板计数和利用本发明方法进行检测并对比。
[0095]
取待测食品样品800μl和实施例1-4中的apt-mcof-aunps 200μl，分别进行测试，室温避光混旋30min。加入fe
3+
，反应3min。在暗室中用365nm紫外光照射，智能手机拍照，用自主研发的app进行hsv分析，以色调值(hue value)作为鼠伤寒沙门氏菌浓度的输出定量信号。平板计数结果与本发明方法结果对比参考表6，本发明方法检测稳定，加标回收率达97.38％-104.56％。
[0096]
表6实施例1检测食品样品中鼠伤寒沙门氏菌的结果
[0097][0098]
表7实施例2检测食品样品中鼠伤寒沙门氏菌的结果
[0099][0100]
表8实施例3检测食品样品中鼠伤寒沙门氏菌的结果
[0101]
[0102]
表9实施例4检测食品样品中鼠伤寒沙门氏菌的结果
[0103][0104]
*
log c：鼠伤寒沙门氏菌的浓度(cfu/ml)对数值。
[0105]
对比例1
[0106]
表10该试剂盒与市售elisa试剂盒比较
[0107] 检测时间检测装置灵敏度变异系数实施例1约33分钟智能手机4cfu/ml小于6％实施例2约33分钟智能手机9cfu/ml小于6％实施例3约33分钟智能手机12cfu/ml小于9％实施例4约33分钟智能手机6cfu/ml小于10％市售elisa试剂盒大于2.5小时精密酶标仪10-104cfu/ml小于10-15％
[0108]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变；都应涵盖在本发明的保护范围内。