EB病毒早期抗原IgA抗体检测试剂盒的制作方法

本发明涉及免疫检测，具体涉及eb病毒早期抗原iga抗体检测试剂盒。

背景技术：

1、eb病毒(epstein barr virus,ebv),又称人类疱疹病毒，它只能在b淋巴细胞中增殖,其感染与多种疾病有关。根据感染后是否产生有感染性的病毒子代,可分为增生性感染和非增生性感染:与增殖性感染相关的抗原有早期抗原、膜抗原和衣壳抗原,已确定的非增殖性感染抗原有核抗原和潜伏感染蛋白.研究ebv的抗原及抗体,对揭示ebv与鼻咽癌的关系以及鼻咽癌的早期诊断均有重要意义。

2、目前eb病毒感染检测方法包括病毒培养、免疫学检测、ebv dna载量检测等。由于ebv存活需要宿主细胞，故病毒体外培养有一定的局限性，如取材一般需要急性期患者的唾液或淋巴细胞,培养的时间较长，阳性率低，一般在临床检测中较少应用。ebv以环状dna形式存在于淋巴细胞胞浆中，90％的人为潜伏性感染，只有活动期的ebv可破坏淋巴细胞，进入血液循环,绝大多数的血浆游离dna片段大小为82～181kb，因此可采用pcr检测血浆中游离dna的含量。但是在早期诊断中灵敏度低，特异性较差。

3、目前ebv检测主要采用免疫学检测方法，通常用酶免疫法或免疫荧光技术检测不同感染阶段产生的抗体。目前的eb病毒检测中，由于样本检测时固相抗原与样本中干扰因子结合产生的非特异性吸附，所导致的背景信号杂乱、免疫诊断结果的假阳性检出率高且灵敏度低等问题尚待解决。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供eb病毒早期抗原iga抗体检测试剂盒，本发明提供了稳定性好、灵敏度高且特异性强的eb病毒早期抗原iga抗体检测试剂盒。

2、本发明提供了一种eb病毒早期抗原iga抗体检测的试剂或试剂盒，包括：

3、固相载体混悬液、酶结合物溶液以及样品稀释剂；

4、所述固相载体混悬液中，固相载体表面包被有eb病毒早期抗原；

5、所述酶结合物溶液中，酶结合物为酶标记的抗人iga抗体；

6、所述样品稀释剂包括小牛血清、蛋白稳定剂、p300和表面活性剂。

7、本发明所述样品稀释剂中，添加表面活性剂从而提高检测的灵敏性、稳定性和特异性。研究表明，表面活性剂的选择对试剂的检测效果产生影响。一些实施例中，样品稀释剂中的表面活性剂的浓度为0.08vol％～5vol％，其种类选自trixton-100、聚乙烯亚胺、十六烷基三甲基溴化铵和聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种。进一步研究表明，与其他表明活性剂及蛋白稳定剂相比，所述样品稀释液中添加trixton-100，更有利于与其他试剂配合，获得更优秀的检测效果。

8、本发明所述样品稀释剂中，蛋白稳定剂、p300和小牛血清能够辅助表面活性剂，使样本的靶标结合位点更好的暴露，获得更准确、灵敏的检测效果。一些实施例中，所述蛋白稳定剂为多羟基糖类，所述多羟基糖类选自蔗糖或海藻糖中的至少一种，具体为蔗糖。

9、一些具体实施例中，所述样品稀释剂中包括水、trixton-100、小牛血清和p300。该样品稀释剂与eb病毒早期抗原及抗人iga抗体的兼容性更高，抗干扰能力更强，从而获得更准确、更灵敏的技术效果。

10、在一些具体实施例中，所述样品稀释剂由水、20vol％～50vol％的小牛血清、1～5mg/ml的蔗糖、0.5vol％～3vol％的p300和0.1vol％～5vol％的trixton-100组成。实验表明，在此组分及浓度下，所述样品稀释液的抗干扰能力最强，与抗体的兼容性最高。

11、本发明所述的固相载体混悬液中，包括表面包被有eb病毒早期抗原的固相载体和缓冲液。其中，表面包被有eb病毒早期抗原的固相载体的制备包括：采用含0.05vol％～0.1vol％表面活性剂的处理剂对eb病毒早期抗原进行活化后，与活化后的固相载体混合，经孵育、封闭获得表面包被有eb病毒早期抗原的固相载体，所述处理剂中的表面活性剂为非离子型表面活性剂。

12、非离子型表面活性剂的末端是非极性的亲水基团，作用较为温和，可以破坏蛋白-脂质、脂质-脂质等结合，但是对蛋白-蛋白的结合不起作用。因此，这种活性剂保留蛋白的天然构象，不使其发生变性，抗原和抗体的功能和相互作用正常。本发明中，在包被前对抗原进行活化预处理，并在活化剂中添加了表面活性剂，从而增加其亲水性及在水溶液中的溶解度，提高其包被效率。与其他抗原活化剂相比，本发明对添加的非离子型表面活性剂进行筛选，从而更好的打开蛋白的二硫键，暴露出更多的反应位点，提升检测的灵敏度。本发明实施例中，在抗原活化步骤中采用的非离子型表面活性剂包括l7600、吐温20、烷基葡糖苷、正-辛基谷氨酸、维生素e聚乙二醇琥珀酸酯或trixton-100中的至少一种。一些实施例中，活化抗原采用的表面活性剂为吐温20。在一些具体实施例中，eb病毒早期抗原的处理剂包括水和0.1vol％的吐温20。其中，所述eb病毒早期抗原的活化条件包括15～25℃反应1小时；

13、在使抗体包被到固相载体前，固相载体也经过活化。本发明中，所述固相载体的基质包括聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、衍生塑料、磁性微球、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜。在一些具体实施例中，本发明优选磁性微球作为固相载体的基质。本发明所述固相载体的活化试剂包括水、醋酸、edc和nhs。其中，醋酸的浓度为0.1vol％～5vol％，edc的浓度为0.5～1mg/ml，nhs的浓度为0.5～1mg/ml。所述固相载体的活化条件包括20～28℃反应1小时；

14、将活化后的抗原与固相载体混合后进行孵育，从而使抗原包被到固相载体上。所述孵育的条件为20℃，震荡孵育1小时；在包被过程中，所述eb病毒早期抗原的浓度为0.1vol％～5vol％。

15、在包被后，还需要对包被产物进行封闭，本发明中所述封闭的试剂为peg8000。

16、封闭后的固相载体以缓冲液重悬制得固相载体混悬液。本发明所述固相载体混悬液中，包被有eb病毒早期抗原的固相载体的浓度为10ul/ml，缓冲液为含蛋白保护剂的tris封闭液。其中，所述蛋白保护剂为蔗糖，其在缓冲液中的浓度为0.1vol％～5vol％，tris在缓冲液中的浓度为0.5mol/l。

17、本发明中，包被有eb病毒早期抗原的固相载体负责捕获待测物中的抗体，而酶结合物用于检测被捕获的抗体。本发明中，所述酶结合物溶液包括酶结合物和缓冲液。其中，酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗人iga抗体。所述酶结合物溶液中，辣根过氧化物酶标记的抗人iga抗体的浓度为1:(1000～5000)，缓冲液为pbs溶液。

18、优选的，还包括校准品溶液，所述校准品包括校准品1和校准品2；

19、所述校准品1溶液中包括阴性人血清和pbs缓冲液，所述阴性人血清为未感染eb病毒的人血清，所述阴性人血清的s/co值＜0.1；

20、所述校准品2溶液中包括阳性人血清和pbs缓冲液，所述阳性人血清为己灭活的抗人iga抗体，所述阳性人血清的s/co值为1.75～3.25。

21、本发明还提供了eb病毒早起抗原的检测方法，包括，采用本发明的eb病毒早期抗原iga抗体检测的试剂或试剂盒对样本进行检测。所述样本包括血清/血浆。

22、本发明提供了一种eb病毒早期抗原iga抗体检测试剂盒，其包括固相载体混悬液、酶结合物溶液以及样品稀释剂，所述固相载体混悬液中，固相载体表面包被有eb病毒早期抗原，所述eb病毒早期抗原采用非离子表面活性剂对其进行活化处理。与现有eb病毒检测试剂盒相比，本发明提供的检测试剂盒稳定性好、灵敏度高、背景信号弱且特异性强。经实验验证，该试剂盒在37℃下储存14天下阳性样本发光值变幅均在±20％以内；检测中抗干扰能力强，50～3000mg/dl的血红蛋白、甘油三酯和胆红素对试剂盒的假阳性与弱阳性样本检测无明显干扰。