一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法与流程

本发明涉及临床医学检验，具体为一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法。

背景技术：

1、近几年肿瘤微环境的研究逐渐成为大家关注的热点，进而肿瘤浸润免疫细胞(t ii cs)进入大家的视野，t i i cs与血液中的免疫细胞是两个概念，t i i cs才是战斗在抗肿瘤细胞“一线”的战士，如果能从t i i cs得到关于疾病早期诊断，治疗方案，预后判断的信息，对于临床和基础研究来说意义重大，基于流式细胞平台检测的t i i cs主要涉及组织标本和体液标本两方面。

2、在组织标本方面：目前，学者们已经建立了适用于流式细胞平台的t i i cs提取技术，例如从肺癌[1]，结直肠癌[2]，胃癌[3]，胰腺癌[4]等组织中提取t i i cs，进行t ii cs表面抗原检测，其特点是：只检测表面抗原，不需要固定破膜，也不需要将荧光抗体导入细胞内部，即可直接进行流式细胞平台检测，对标本处理技术要求不高。

3、而对于流式细胞平台固定破膜检测项目，若使用现有的组织标本处理方法，会出现以下问题：1.会导致固定破膜操作时免疫细胞的细胞膜破裂，细胞裂解成碎片，导致固定破膜失败，无法进行流式细胞分析；2.固定破膜成功的，在导入荧光抗体后进行检测时出现细胞变形，无法划分细胞类型，不能满足检测需要；3.现有技术因不涉及细胞内部代谢靶蛋白的检测项目，会存在淋巴细胞分离液、商售血清等试剂的使用，影响细胞代谢状态从而造成检测结果的偏倚，不适用于检测项目；4.部分病人因各种原因无法进行手术切除的，只能进行穿刺诊断，现有的组织标本处理局限于新鲜组织或者蜡块组织，对组织块有量的要求，标本取材方面受到限制。

4、在体液标本检测方面：目前国内外还没有使用流式细胞平台检测体液标本免疫细胞内靶蛋白的体液标本处理技术方法，故而，提出了一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法来解决上述问题。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，解决了多种类型临床标本和动物实验标本的处理技术难点，从而得到可用于固定破膜后进行细胞内代谢蛋白质和关键酶检测的肿瘤浸润免疫细胞(t i i cs)悬液，实现基于流式细胞平台，构建t i i cs代谢轮廓的目的，同时，为不同疾病患者和动物模型提供了便捷多样的取材方式，实现了从不同类型标本的角度构建t i i cs立体代谢模型，寻找有价值的生物标志物的目的，从而成为临床诊断、分型、预后、分期、治疗和监测不可或缺的工具。

3、(二)技术方案

4、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，包括以下步骤：

5、1)样本预处理；

6、2)红细胞裂解液重悬；

7、3)加入细胞表面抗体孵育；

8、4)固定破膜；

9、5)加入细胞内部抗体孵育。

10、优选的，所述样本分为组织样本和体液样本，所述组织样本分为软组织样本和硬组织样本。

11、优选的，所述软组织样本处理方法中样本预处理包括：

12、1)收集新鲜组织，在0-37℃的1ⅹpbs中浸泡，并清洗组织中的血液；

13、2)组织剪碎后组织匀浆；

14、3)尼龙网上搓成单细胞悬液；

15、4)细胞滤网过滤；

16、5)离心，去除组织细胞；

17、6)离心，将肿瘤浸润免疫细胞沉淀。

18、优选的，所述软组织样本处理方法具体为：

19、1)手术标本或者穿刺标本采集后立即收集新鲜组织，放在装有组织储存液的试管里，置于由冰块包裹的泡沫箱中运回实验室，一小时内进行检测，将新鲜组织在0-37℃的1ⅹpbs中浸泡2-8分钟，将组织中的血液清洗干净；

20、2)在超净工作台上取出组织标本，冰浴2-18分钟，将300目的网固定于平皿口，置于冰上，用锋利的剪刀将组织剪碎后，把剪碎的组织放在网上，眼科镊子固定并轻搓组织块，边搓边加0-37℃的1ⅹpbs冲洗，直至将组织搓完；

21、3)用移液器吹打混匀，经100目细胞滤网过滤，移入离心管，条件0-37℃，50g离心2-8分钟，去除组织细胞，将上清液移入流式上样管中，条件0-37℃，800g离心2-8分钟，倒上清液，用卫生纸沾走管口余液；

22、4)加入2m l红细胞裂解液涡旋震荡为细胞悬液，室温静置2-18分钟，条件0-37℃，400g离心2-8mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入2m l的0-37℃的1ⅹpbs，轻弹几下，条件0-37℃，400g离心2-8mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入50u l 0-37℃1ⅹpbs，吸取2μl细胞悬液用0-37℃1ⅹpbs稀释10倍，用于细胞计数，然后构建反应体系，后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)。

23、优选的，所述硬组织样本处理方法中样本预处理包括：

24、1)收集新鲜组织，在0-37℃的1ⅹpbs中浸泡，并清洗组织中的血液；

25、2)组织剪碎后组织匀浆；

26、3)酶解成单细胞悬液；

27、4)离心，去除组织细胞；

28、5)离心，将肿瘤浸润免疫细胞沉淀。

29、优选的，所述硬组织样本处理方法具体为：

30、1)手术标本或者穿刺标本采集后立即收集新鲜组织，放在装有组织储存液的试管里，置于由冰块包裹的泡沫箱中运回实验室，一小时内将新鲜组织在0-37℃1ⅹpbs中浸泡2-8分钟，将组织中的血液清洗干净；

31、2)在超净工作台上取出组织标本，置于冰上，用锋利的剪刀将组织剪碎后，根据组织体积加入5-6倍的酶解液，35-39℃摇床消化30-40分钟，加入相同代谢状态下采集的本人血清终止消化，将300目的尼龙滤网固定于平皿口，置于冰上，将消化后的液体过滤，用0-37℃的1ⅹpbs冲洗3次；

32、3)用加样枪吹打混匀，经100目细胞滤网过滤，移入离心管，条件0-37℃，50g离心2-8分钟，去除组织细胞，将上清液移入流式上样管中，条件0-37℃，800g离心2-8分钟，倒上清液，用卫生纸沾走管口余液；

33、4)加入2ml红细胞裂解液涡旋震荡为细胞悬液，室温静置2-18分钟，条件0-37℃，400g离心2-8mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入2ml0-37℃1ⅹpbs，轻弹几下，条件0-37℃，400g离心2-8mi n，弃上清，用卫生纸沾走管口余液，加入50u l 0-37℃1ⅹpbs，吸取2μl细胞悬液用0-37℃1ⅹpbs稀释10倍，用于细胞计数，后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)。

34、优选的，所述体液标本的处理方法中样本预处理包括：

35、1)体液标本过滤，形成单细胞悬液；

36、2)0-37℃的1ⅹpbs冲洗；

37、3)一次性吸管移去上清液。

38、优选的，所述体液标本的处理方法具体为：

39、1)粪便用塑料容器取材后用0-37℃1ⅹpbs稀释，用300目尼龙网过滤至离心管中，再按照如下1.2.3进行；

40、2)尿液标本、肺泡灌洗液、痰、呕吐物、脑脊液、胸腔液、腹腔液、引流液、关节液、前列腺液、阴道分泌物11种液体标本尽量取够4ml进行检测，如果标本量不够，则根据细胞计数情况构建反应体系，再按照如下1.2.3进行；

41、详细操作步骤为：

42、1)体液标本加入离心管放置于冰上，用一次性吸管吹打体液标本，并吸取样本，用100目尼龙网过滤至离心管中，0-37℃1ⅹpbs冲洗尼龙网两次，涡旋震荡为细胞悬液，条件0-37℃，50g，离心2-8mi n，去除组织细胞，将上清液移入新的离心管中；

43、2)条件0-37℃，300g，离心3-7mi n，用一次性吸管将离心后的上清弃去，留下大约150-200ul，注意在吸取时不要破坏白细胞层，用移液器适度吹打剩余样本，吸取2μl细胞悬液用0-37℃1ⅹpbs稀释10倍，用于细胞计数，流式管中加入50ul吹打均匀的样本(可依据实际计数的细胞浓度来定加入的样本体积)；

44、3)加入450ul的1x红细胞裂解液(体液在取样过程中可能会夹杂少许红细胞，所以需要加少量裂红素)，室温孵育2-18mi n，后续进行表面抗原的反应，固定破膜操作，将携带荧光素的抗体导入细胞内部，上机检测(待检测的上样管保持冰浴)。

45、(三)有益效果

46、与现有技术相比，本发明提供了一种用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，具备以下有益效果：

47、1、该用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，可用于组织标本和体液标本中t i i cs内代谢蛋白和关键酶检测，创新性的提出了多种体液标本处理技术，基于本发明中组织标本的处理技术，结合临床和动物实验标本的多样性，建立了尿液、粪便、肺泡灌洗液、痰、呕吐物、脑脊液、胸腔液、腹腔液、引流液、关节液、前列腺液、阴道分泌物12种体液标本的处理技术，从这些标本直接获取组织内炎症免疫效应细胞，是探讨组织局部免疫病理过程的一种比较安全和有用的检查方法，给无法进行手术切除组织，也无法进行组织穿刺检测的患者带来福音。

48、2、该用于流式检测项目的组织和体液标本处理方法，通过将现有组织标本处理技术进行改进，获得合格的t i i cs悬液，能够继续进行固定破膜-将荧光抗体导入细胞内部的操作，从而利用流式细胞平台检测t i i cs内部代谢相关靶蛋白和关键酶，最大限度地剔除或替换了影响细胞代谢的试剂，更符合细胞内代谢靶蛋白和关键酶检测项目需求，同时，本发明构建了不同细胞量标本的对应反应体系，实现了穿刺组织标本的检测，创新性的提出了多种体液标本处理技术，并且构建了反应体系以及对两种试验方案的确定，为肿瘤微环境和液体活检提供了新的研究角度。