一种用于外泌体中补体检测的裂解液及其应用的制作方法

本技术属于医疗器械，具体涉及一种用于外泌体中补体检测的裂解液及其应用。

背景技术：

1、补体(complement，c)是存在于正常人和动物血清与组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质，可辅助和补充特异性抗体，介导免疫溶菌、溶血等作用。补体由9种成分组成，分别命名为c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9，其中c4表达量最高。补体分子是分别由肝细胞、巨噬细胞以及肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生的。

2、外泌体是指包含了复杂rna和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，外泌体天然存在于体液中，外泌体在介导细胞通讯中起到重要作用，当其由宿主细胞被分泌到受体细胞中时，外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。如今，外泌体作为有潜力的疫苗及补体递送系统，正在被大量应用。所以，检测外泌体中补体的含量成为该过程中至关重要的环节。

3、现有的补体检测主要是检测血液中的补体，然而对于外泌体中补体的检测鲜有涉及。现有的补体检测方法主要包括免疫溶血法和免疫化学法，前者主要用于经典途径和旁路途径总补体活性的检测；后者包括单向免疫扩散、免疫电泳法、免疫透射比浊法和免疫散射比浊法，主要用于c3、c4和c1q等补体单个成分含量的检测。其中溶血法比较便捷，无需特殊的设备，但敏感性比较低，影响因素较多，只能检测总补体活性，无法明确测定补体成分的具体含量。单向免疫扩散法和免疫电泳法因其操作繁琐和重复性较差而趋于淘汰，免疫透射比浊法和免疫散射比浊法具有简单、快速、定量准确、重复性好并且自动化程度高等优点，是现在目前临床实验室常用的检测方法。

4、在外泌体中检测补体，需要先使用裂解液将组织或细胞裂解，裂解液的配方非常关键，使用不当会导致较大的基质效应。同时，由于补体的稳定性较差，酸、碱等各种理化因素都可使之失活。

5、因此，提供一种能够降低基质效应并使得补体保持活性的裂解液，以提高补体检测的灵敏度显得尤为重要。由于外泌体中补体含量较低，本技术用高灵敏度的电化学发光方法进行检测，c4作为补体典型代表，本技术用c4作为检测指标。

技术实现思路

1、1.要解决的问题

2、本技术针对外泌体中补体检测过程中存在的基质效应高、裂解后补体蛋白活性低、检测灵敏度低等问题，提供了一种用于外泌体中补体检测的裂解液及其应用，该裂解液包括100～200mm nacl，10～30mm tris-hcl，ph 7.5 0.8～1.2mm edta，0.8～1.2mm egta，0.5％triton-x-100，0.1％ bsa。与现有细胞裂解液ripa相比，由于补体稳定性较差，去除了离子去垢剂成分sds，适当降低了破膜成分triton-x-100，并加入了一些稳定剂egta，从而保护了裂解后补体的稳定性。将其用于制备基于电化学发光技术的外泌体中补体检测试剂盒，在保护了外泌体裂解后补体的稳定性的同时，利用电化学发光技术，降低基质效应，提高补体的检测灵敏度。

3、2.技术方案

4、为了解决上述问题，本技术所采用的技术方案如下：

5、本技术提供了一种用于外泌体中补体检测的裂解液，该裂解液成分包括：100～200mm nacl，10～30mm tris-hcl，ph 7.5 0.8～1.2mm edta，0.8～1.2mm egta，0.5％triton-x-100，0.1％ bsa，本技术的裂解液与现有裂解液相比，去除了离子去垢剂成分sds，适当降低了破膜成分triton-x-100，并加入了一些稳定剂egta，从而保护了外泌体裂解后补体的稳定性，降低基质效应。

6、进一步地，上述裂解液成分包括：100mm nacl，10mm tris-hcl，ph 7.5 0.8mmedta，0.8mm egta，0.5％ triton-x-100，0.1％ bsa。

7、进一步地，上述裂解液成分包括：150mm nacl，20mm tris-hcl，ph 7.5 1mm edta，1mm egta，0.5％ triton-x-100，0.1％ bsa。

8、进一步地，上述裂解液成分包括：200mm nacl，30mm tris-hcl，ph 7.5 1.2mmedta，1.2mm egta，0.5％ triton-x-100，0.1％ bsa。

9、本技术还提供了上述一种用于外泌体中补体检测的裂解液在制备外泌体中补体检测试剂盒中的应用。

10、进一步地，上述试剂盒是基于电化学发光技术的外泌体中补体检测试剂盒。

11、本技术还提供了一种基于电化学发光技术的外泌体中补体检测试剂盒，该试剂盒包括：

12、外泌体提取试剂盒，用于提取外泌体；该试剂盒为本领域已经公开的试剂盒，如爱必信(上海)生物科技有限公司的外泌体提取试剂盒(exosome isolation kit，货号：abs50035)；

13、裂解液，用于裂解外泌体获得补体，裂解液为上述任一用于外泌体中补体检测的裂解液；

14、msd板及msd读板液，用于提供载体及msd板检测；msd板及msd读板液为本领域已经公开的内容，如msd read buffer t(4x)，meso scale discovery r92tc-2；

15、捕获抗体，用于捕获待测补体；捕获抗体可以根据补体的需要进行设置，可以通过重组表达或者购买市售产品，如待测补体是补体c4时，捕获抗体为c4a(proteintech，catno.22233-1-ap)；

16、检测抗体，用于检测待测补体；检测抗体可以根据补体的需要进行设置，可以通过重组表达或者购买市售产品，如待测补体是补体c4时，检测抗体为c4-b alpha chain(catno.55228-1-ap，55228-1-ap targets c4-b alpha chain/c4b-b/c4d-b in wb，elisaapplications and shows reactivity with human samples)。

17、进一步地，上述一种基于电化学发光技术的外泌体中补体检测试剂盒还包括：稀释液，用于稀释样品或试剂；该稀释液为本领域常用稀释液，如pbs缓冲液。

18、本技术还提供了上述一种基于电化学发光技术的外泌体中补体检测试剂盒在检测外泌体中补体的应用。

19、进一步地，上述应用包括如下步骤：

20、s1，样本制备：外泌体提取试剂盒得到外泌体，用本发明的外泌体裂解液进行裂解后，3000g离心5min，bca蛋白定量以备后续使用；

21、s2，稀释捕获抗体到1:500，按照50μl/孔的条件依次加到对应的孔中，用手轻轻敲击msd侧壁，确定溶液铺满孔底，且无气泡后，用封板膜封闭，室温摇床孵育1小时，做好计时；孵育时间结束后，用至少150μl/孔的1×msd洗涤缓冲液或pbs-t洗涤3次；在洗板时，可采用每洗一次将板子旋转180°再进行清洗；同一试剂盒多次实验时，孵育时间应保持一致，且做好记录；

22、s3，封闭，3％bsa(1×pbst)室温封闭60分钟，每孔150μl；

23、s4，稀释样本：样本梯度稀释4ng/ml，3倍稀释，8个浓度(包含0点)；

24、s5，加入样本裂解液100μl，孵育1h后洗板；

25、s6，准备检测抗体稀释液：吸取一抗各5.5μl，并用稀释液3％bsa(1×pbst)分别补足5.5ml体积(1:1000稀释)；每孔加入配置好的50μl一抗，并用封口膜封上，室温600±50rpm振荡1小时(期间配置二抗)；

26、s7，清洗msd板3次，每次150μl的清洗液；

27、s8，每孔加入配置好的50μl二抗，并用封口膜封上，室温600±50rpm振荡1小时；

28、s9，清洗msd板3次，每次150μl的清洗液；

29、s10，每孔加入150μl配置好的读板液，上机检测。

30、3.有益效果

31、本技术与现有技术相比，其有益效果在于：

32、(1)本技术提供的一种用于外泌体中补体检测的裂解液，该裂解液成分包括：100～200mm nacl，10～30mm tris-hcl，ph 7.5 0.8～1.2mm edta，0.8～1.2mm egta，0.5％triton-x-100，0.1％ bsa，本技术的裂解液与现有裂解液相比，去除了离子去垢剂成分sds，适当降低了破膜成分triton-x-100，并加入了一些稳定剂egta，从而保护了外泌体裂解后补体的稳定性。

33、(2)本技术提供的一种基于电化学发光技术的外泌体中补体检测试剂盒及其应用，该试剂盒中包括本发明提供的裂解液，保护了裂解后补体蛋白的稳定性，降低了补体检测的基质效应，同时利用电化学发光技术，提高补体的检测灵敏度。