一种用于生物大组织高分辨率成像的标记方法

本发明涉及生物装置领域，具体涉及一种用于生物大组织高分辨率成像的标记方法。

背景技术：

1、动物机体的基本功能结构单元是细胞，不同的细胞类型在不同的器官、系统中扮演着重要的角色。机体发生病变，往往是从细胞尺度的结构功能发生变化开始。通过单纯的分子生物学实验对细胞进行研究，无法将其定位到具体的器官位置，无法获取其在整体解剖结构上的三维空间信息。比如脑器官，脑是人体完成各种生命活动必不可少的器官，其中负责传递信息的神经结构组成了一个高度复杂、相互联系的网络，对各种信息进行整合处理，维护着身体正常运行，大脑的功能失调与一系列不治之症相关。脑的细胞组成主要分为神经元和神经胶质细胞两大类。神经元细胞是神经系统的功能单位，它们之间相互联结形成的复杂网络结构是所有动物行为实现的基础。目前对脑的研究从微观至宏观不同尺度展开，随着分子生物学的发展，人们对分子、细胞结构的了解已经很详尽，但是对于大尺度脑神经的空间结构研究目前还在不断探索中。

2、对于生物组织的研究，成像是最直接有效的方法。随着生命科学研究的不断深入，仅对生物样本的物理切片进行结构观察研究，已经无法满足器官功能研究的迫切需要。例如，在神经系统相关研究中，由于大多数神经元向多个方向延伸，形成复杂的神经网络，而单个微米尺度切片的结构信息无法提供整个神经系统的3d结构。脑部神经投射、血管网络结构以及肿瘤微环境等重要科学问题的研究，都需基于大尺度样本的三维空间信息进行分析研究。

3、x射线波长短及穿透能力强，具有各向同向、高分辨率、三维成像等特点，且无需组织连续切片，可以对完整样品进行多尺度三维高分辨率成像。

4、适用于x射线成像的样品制备方法，关键点是目标结构产生合适的反差。样品的制备可以分为直接法和标记法，直接法指对样品不进行标记处理，依靠组织本身和介质的反差。标记法一般指通过化学试剂与组织发生化学结合或物理吸附，对目标结构进行特定标记，用于x射线成像常见的标记物是重金属。通过金属沉积在目标结构上，提高目标结构在x射线图像中的对比度，然后通过后期图像处理等信息处理手段获得目标结构的图像信息。

5、以常用动物模型-小鼠为例，数据显示6-8周龄的小鼠脑平均大小约为15mm×13mm×7mm，包含大约7500万个神经元和2300万个神经胶质细胞，获取小鼠脑的神经网络结构，需对特定细胞表型(结构)进行均匀可控的组织染色标记。即获取厘米量级的器官(如小鼠大脑)在纳米尺度的3d结构信息，需要一种能用于x射线3d高分辨率成像的特异性标记生物组织特定结构的方法。在以下现有方法中，都无法有效地解决以上问题。

6、目前结合x射线使用重金属标记的方法主要有以下几种：

7、一种是基于重金属铬、银或汞标记脑神经结构的浸染方法，称为高尔基染色方法。该染色方法具有随机性，可重复性较差，无法对轴突进行标记，对于脑结构研究有一定的局限性。此外，该方法适用范围局限于标记神经结构。

8、另一种方法是基于四氧化锇(oso4)对膜磷脂的亲和性，通过沉积的金属锇在图像上产生反差，从而根据膜结构分辨出细胞结构。锇酸反应迅速，对于毫米尺度的样本存在染色不均匀的问题。该方法是将所有磷脂膜进行标记，只能观察具有磷脂膜的结构轮廓，对特定结构的标记研究不可行。

9、还有一种方法是将免疫组织化学方法中使用的抗体结合上纳米金颗粒，然后按照免疫组化的实验流程对目标结构进行特异性标记，结合在抗体上的纳米金颗粒则在x射线下产生反差。该方法可以对感兴趣的结构进行特异性标记，但是无法控制反差的强度。

10、此外，现有的方法情况如下：1)要么需要连续切片，耗时费力且存在物理误差；2)用锇酸标记的组织虽然可以直接做x射线成像，但是没有特异性，背景信号太大；3)免疫组化方法虽然可以实现特异性标记，但是，仅靠dab显色反应后产生的褐色沉淀在x射线下无法产生有效反差，而且对于毫米级样本已经无法做到均匀显色，厘米量级的器官就更加困难。尽管基于该技术的其他方法(比如抗体结合纳米金)增强了反差，但是，组织体积增大后依然存在显色不均匀的问题；4)合适的反差强度是x射线成像的关键点，现有的方法无法实现对反差强度的可控性调节。

11、总而言之，要想获取厘米量级的器官(如小鼠大脑)特定结构在纳米尺度的3d结构信息，需要同时解决特异性标记、大尺度样本均匀标记和反差强度可控三个问题，现有的方法无法实现，多种方法组合也无法实现，目前暂无符合以上要求的可行性方案。

12、因此，本领域迫切需要开发一种能直接获取厘米量级的器官(如小鼠大脑)在纳米尺度的3d结构信息且能够同时解决特异性标记、大尺度样本均匀标记和反差强度可控三个问题的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种能直接获取厘米量级的器官(如小鼠大脑)在纳米尺度的3d结构信息且能够同时解决特异性标记、大尺度样本均匀标记和反差强度可控三个问题的方法。

2、本发明的另一目的在于通过该套实验方法，实现脑神经网络的构建。

3、本发明第一方面提供了一种对组织样本进行均匀可控性免疫标记的方法，包括步骤：

4、(a)提供一待进行免疫标记的组织样本，所述组织样本为去磷脂的组织样本，并且所述组织中含有多种不同的抗原靶标；

5、(b)将第一抗体与所述组织样本进行孵育，所述第一抗体特异性结合所述多种不同的抗原靶标中的一种，形式第一抗体-抗原靶标复合物；

6、(c)将偶联酶的第二抗体与所述第一抗体-抗原靶标复合物孵育；

7、(d)在低温条件下，加入显色剂，渗透所述组织样本；

8、(e)在低温条件下，加入双氧水，进行显色；

9、(f)加入重金属盐进行低温渗透，从而对所述组织样本进行免疫标记，获得经免疫标记的组织样本。

10、在另一优选例中，所述的方法还包括：(g)对所述经免疫标记的组织样本进行检测。

11、在另一优选例中，在步骤(g)中，所述的检测包括x射线成像检测。

12、在另一优选例中，所述检测包括使用共聚焦显微镜、正置显微镜、扫描电镜和原子力学显微镜的方法进行检测。

13、在另一优选例中，酶与显色剂反应，生成初级反应产物。

14、在另一优选例中，所述重金属盐包括锇酸。

15、在另一优选例中，所述初级反应产物与重金属盐作用后，生成最终反应产物。

16、在另一优选例中，所述最终反应产物包括金属离子。

17、在另一优选例中，用cubic方法进行去磷脂。

18、在另一优选例中，采用透明化方法，如有机溶剂的透明化方法(如3disco,fdisco等)和水凝胶的透明化方法(如clarity，shiled等)去磷脂。

19、在另一优选例中，用其他可以去除磷脂的方法，只要保证磷脂的有效去除即可。

20、在另一优选例中，所述的组织样本是动物或者植物样品。

21、在另一优选例中，所述组织样本选自下组：脑组织、胃组织、肝组织、肺组织、或其组合。

22、在另一优选例中，所述组织样本来源于哺乳动物、人、或其组合。

23、在另一优选例中，所述组织样本来源于小鼠、大鼠、人、或其组合。

24、在另一优选例中，所述样本为片状样本，具有第一主表面和第二主表面。

25、在另一优选例中，所述的组织样本(片状样本)的厚度为0.5-1mm。

26、在另一优选例中，所述的组织样本(片状样本)的截面积为10-30mm2，较佳地，20-30mm2。

27、在另一优选例中，所述步骤(c)中的酶包括辣根过氧化物酶(hrp)。

28、在另一优选例中，所述显色剂包括dab。

29、在另一优选例中，所述显色剂的浓度为10％-50％，较佳地，20％-25％。

30、在另一优选例中，所述双氧水的浓度为10-50％，较佳地，20-40％。

31、在另一优选例中，所述步骤(d)中，加入一次或多次显色剂。

32、在另一优选例中，所述锇酸的浓度为0.5％-2％，较佳地，0.8-1.5％。-

33、在另一优选例中，所述低温条件指温度低于8℃，较佳地，4-5℃。

34、在另一优选例中，在步骤(c)之前，还包括用1-8％，较佳地，3-6％的双氧水浸泡所述组织样本的步骤。

35、在另一优选例中，所述步骤(a)之前还包括灌注、取样并固定的步骤。

36、在另一优选例中，所述方法还包括图像处理步骤。

37、在另一优选例中，所述的方法为非诊断性和非治疗性的体外方法。

38、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。