一种5-HT的检测方法与流程

【】本发明属于检测，具体涉及一种5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-ht)浓度或含量的检测方法。

背景技术

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背景技术：

1、5-羟色胺是一种吲哚衍生物，简称5-ht，化学式为c10h12n2o，分子量为176.22。5-羟色胺最早是从血清中发现的，又名血清素，广泛存在于哺乳动物组织中，特别在大脑皮层质及神经突触内含量很高，它也是一种抑制性神经递质。在外周组织，5-羟色胺是一种强血管收缩剂和平滑肌收缩刺激剂。在体内，5-羟色胺可以经单胺氧化酶催化成5-羟色醛以及5-羟吲哚乙酸而随尿液排出体外。

2、5-羟色胺作为人体内重要的吲哚胺类神经递质，具有调节生物节律、情绪、认知、清除自由基、促进炎信号传导等多种生物活性，同时还对骨代谢有着重要的影响。近年来的国内外研究发现，5-羟色胺参与了骨形成和骨重吸收的过程，包括中枢5-羟色胺的促进成骨作用和外周5-羟色胺对骨形成的负性调节作用；同时可以通过促进opg分泌和消除破骨细胞自由基来抑制破骨细胞分化，5-羟色胺在维持骨代谢动态平衡中都扮演着至关重要的角色，为骨质疏松等骨代谢疾病提供了新的靶点和方向。

3、由于5-羟色胺广泛的存在和参与多种病理和生理学过程，其含量测定对多种疾病(如抑郁症、强迫症、神经性厌食等精神类疾病)的诊断、预测及治疗具有重要意义。5-ht的水平与动物的攻击行为密切相关，可以用于对性格温和的动物和性格暴躁的动物的筛选、区分，相关报告可参见《畜牧与兽医》，52(1)，2020，56－61。在药物筛选过程中，为了衡量候选药物对于动物体内5-ht水平的影响，往往也需要分析给药组和空白模型组5-ht在组织(如血小板、血浆)中的含量以判断候选药物的活性。此外，除了动物，在真菌和植物中也发现5-羟色胺，5-羟色胺在昆虫毒液和植物的刺中存在，会引起疼痛。其广泛存在于许多种子和果实中可能有助于刺激消化道排出种子，帮助植物播种。因此，检测分析其5-羟色胺的含量也是非常重要的。

4、按照分布部位，任何哺乳动物的血清素(5-ht)被血脑屏障分隔为中枢血清素和外周血清素，人体内90％的5-ht存在于消化道黏膜，8％～10％存于血小板，1％-2％存在于中枢系统中，另有少量部分存在于各组织的肥大细胞中。目前5-ht的检测方法繁多，包括酶联免疫法、免疫荧光法、高效液相色谱法、高效液相色谱－电化学法、高效液相色谱－荧光法、高效液相色谱－程序波长紫外检测法、超高效液相色谱－串联质谱法(hplc-ms/ms)等。

5、相对于血浆，血小板中含有较多量的5-ht，《上海精神医学》，19(2)，82-84，94公开了一种血小板中5-ht浓度的检测方法，其需要分离血液样品中的血小板，对血小板进行计数，并测量血小板中的5-ht含量。虽然血浆样品的获得相对于血小板的获得相对容易，但由于血浆中5-ht浓度相对较低，因此对血浆样品中5-ht的检测需要更高灵敏度的方法和仪器设备。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、针对现有技术的不足，本发明建立了一种快速、准确的直接测定样品中5-ht浓度的方法。本发明的方法前处理简单，分析时间短，分析方法稳定，检测限低，适合临床及科研快速检测的需求。为实现上述技术目的，本申请采用如下技术手段：

2、提供一种5-羟色胺(5-ht)浓度的检测方法，其特征在于所述如下步骤：

3、(1)将待检测样品加入5-羟色胺衍生试剂a和亚硫酸盐，所述衍生试剂a选自苯并1,3-苯并二氧戊环-6,7-二甲醛优选的所述亚硫酸盐选自水溶性亚硫酸盐，优选为亚硫酸钠、亚硫酸钾中的一种或两种。

4、(2)将加入衍生试剂后的待检测样品孵育；

5、(3)任选的，将孵育后的待检测样品通过装有固定相的flash柱，然后用流动相洗脱；

6、(4)使用hplc或者hplc-ms方法检测5-羟色胺与衍生试剂孵育后产物的浓度，依据5-羟色胺与衍生试剂孵育后产物的浓度推算5-羟色胺的浓度；或者使用hplc或者hplc-ms方法检测步骤(3)的洗脱液中5-羟色胺与衍生试剂反应后产物的浓度，依据所述洗脱液中产物的浓度推算5-羟色胺的浓度。

7、本发明所述的5-羟色胺(5-ht)浓度的检测方法排除疾病的诊断或治疗方法。

8、进一步的，本发明步骤(2)孵育后产物具有式(1)所示的结构：

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11、进一步的，本发明所述的待检测试剂为血浆，当待检测样品为血浆时，在步骤(1)之前还包括加入蛋白沉淀试剂以沉淀蛋白的步骤a；优选的，所述蛋白沉淀试剂选自高氯酸、三氯醋酸、磷酸、苦味酸、重金属离子如汞离子、铜离子中的一种或多种。

12、进一步的，在加入衍生试剂之前将待检测样品的ph调节至6.5-8.0。

13、进一步的，步骤(2)的孵育时间温度为20-30℃，优选为21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃。

14、进一步的，步骤(1)中衍生试剂a、亚硫酸盐的量为5-ht平均摩尔量的10倍以上，优选为5-ht平均摩尔量的10-1000倍或10-100倍。

15、进一步的，步骤(3)中所述的固定相选自十八烷基键合硅胶、阴离子交换树脂；优选的，所述阴离子交换树脂选自弱碱型阴离子交换树脂。

16、进一步的，步骤(3)中所述的固定相的体积为待检测样品体积的0.1-1倍，优选为0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍或0.9倍。

17、进一步的，本发明还提供了如下结构的式i化合物：

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19、进一步的，本发明还提供了化合物a作为5-羟色胺(5-ht)浓度的检测衍生试剂或标记物的用途。

20、进一步的，本发明还提供了苯并[d][1，3]二氧基-5，6-二甲醛和亚硫酸盐作为5-羟色胺浓度检测衍生化试剂的用途。

21、本发明具有以下有益效果：

22、(1)通过衍生化反应获得的产物的摩尔吸光系数(ε)相对于5-羟色胺大为提高，可以有效的提高hplc紫外检测的灵敏度和检测限，尤其适用于痕量5-羟色胺样品的检测。

23、(2)flash柱操作快速简便，特别是当使用高通量flash柱时(如96孔板flash柱)，可以一次检测多个样品，有效提高检测效率。

24、(3)flash柱不仅可以选择性吸附衍生化后的产物，排除样品中其他杂质对于检测的影响；如果采用hplc-ms检测，可进一步降低“错检”、“漏检”的几率，提高检测准确度。

25、(4)flash柱可以实现待检测样品中式(i)化合物的富集，尤其适用于痕量5-羟色胺样品的检测。

技术特征：

1.一种5-羟色胺(5-ht)浓度的检测方法，其特征在于所述如下步骤：

2.根据权利要求1所述的5-羟色胺(5-ht)浓度的检测方法，其特征在于所述步骤(2)孵育后的产物具有式(i)所示的结构：

3.根据权利要求1所述的5-羟色胺(5-ht)浓度的检测方法，其特征在于所述的待检测试剂为血浆，当待检测样品为血浆时，在步骤(1)之前还包括加入蛋白沉淀试剂以沉淀蛋白的步骤a。

4.根据权利要求1所述的5-羟色胺(5-ht)浓度的检测方法，其特征在于所述的在加入衍生试剂之前将待检测样品的ph调节至6.5-8.0。

5.根据权利要求1所述的5-羟色胺(5-ht)浓度的检测方法，其特征在于所述的步骤(2)的孵育时间温度为20-30℃。

6.根据权利要求1所述的5-羟色胺(5-ht)浓度的检测方法，其特征在于所述的步骤(1)中衍生试剂a、亚硫酸盐的量为5-ht平均摩尔量的10倍以上。

7.根据权利要求1所述的5-羟色胺(5-ht)浓度的检测方法，其特征在于所述的步骤(3)中所述的固定相选自十八烷基键合硅胶或阴离子交换树脂。

8.根据权利要求1所述的5-羟色胺(5-ht)浓度的检测方法，其特征在于所述步骤(3)中所述的固定相的体积为待检测样品体积的0.1-1倍。

9.如下结构的化合物或其药学上可接受的盐：

10.权利要求9所述的化合物或其药学上可接受的盐作为5-羟色胺(5-ht)浓度的检测标记试剂的用途。

技术总结
本发明公开了一种5‑羟色胺衍生化的检测方法，所述衍生化试剂为苯并1,3‑苯并二氧戊环‑6,7‑二甲醛，本发明的方法可以有效的提高高效液相(HPLC)紫外检测的灵敏度和检测限，尤其适用于痕量5‑羟色胺样品(如血浆中痕量5‑羟色胺)的检测。5‑羟色胺广泛的存在和参与多种病理和生理学过程，其含量测定对于多种疾病(如抑郁症、强迫症、神经性厌食等精神类疾病)的诊断、预测及治疗具有重要意义。

技术研发人员：林萍,林治光,金伟峰
受保护的技术使用者：上海市精神卫生中心（上海市心理咨询培训中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13