快速测定可溶性ST2含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的制作方法

本发明涉及医用诊断试剂领域，特别是涉及一种采用磁微粒化学发光技术和抗原-抗体结合技术检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒。

背景技术：

1、可溶性生长激素刺激表达基因2蛋白(以下简称st2)是心肌细胞受到生物机械应力后产生的一种心肌蛋白，研究发现st2可由心脏成纤维细胞和心肌细胞表达，是生物机械应力诱导产生的一种心肌蛋白。参与多种病理生理过程，具有免疫调节功能，尤其在各种炎症性和变态反应疾病中发挥重要作用。此外，st2含量的定量测定有助于临床医生很好的为心衰患者做预后风险评估。

2、根据现有技术中已经发表的研究成果表明：st2值高于临床阈值患者的死亡的风险很高，相反，st2低于阈值则死亡率低很多，故根据st2值预测死亡率；根据现有技术中研发成果表明：st2浓度与心衰严重程度有关，当st2浓度高于35.0ng/ml阈值时提示预后不良的风险较高。急性冠脉综合征患者，如果st2水平高于35.0ng/ml，在30天内死亡或发展为心衰的风险比那些st2浓度低于阈值患者的风险高3倍，一年内的相对风险高2.3倍，同时根据现有技术中研发成果表明：st2参与心肌重建过程，可以用来辅助判别病人对于依普利酮(eplerenone)等抗心肌纤维化药物的治疗效果。

3、针对目前对st2的检测技术，李登红等人发表的《可溶性生长刺激表达基因2蛋白检测方法的研究进展》中提到了目前检测st2的几种方法：有elisa、层析法、双色上转换纳米粒子荧光免疫分析技术和化学发光法，前三种方法存在着灵敏度低、线性范围窄、重复性和定量准确性差的缺点，而磁微粒化学发光法具有操作简单、灵敏度高、线性范围宽且重复性好的特点。但现有的磁微粒化学发光法，基于双抗体夹心法原理，多为两种试剂组分的试剂盒，即磁微粒试剂组分和催化酶或吖啶酯试剂组分，检测时要进行两次取样，一定程度上增加了操作时间和操作的复杂性。另外，现有的专利中，st2磁微粒化学发光法检测试剂盒，所选磁微粒表面均带有羧基活性基团，在抗体包被过程中，需要活性剂edc对磁微粒表面基团进行活化，但edc容易潮解，需现配现用，增加了操作的复杂性。

技术实现思路

1、本发明旨在开发一种制备简单，灵敏度高、无污染、操作简单、快速、特异性好并且成本低廉的一种测定可溶性生长刺激表达基因2蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒。

2、基于上述目的，在磁微粒化学发光平台的基础上，本发明提供一种快速测定可溶性生长刺激表达基因2蛋白含量的单一试剂组分检测试剂盒，无试剂r1和试剂r2，单一试剂组分即为磁微粒和吖啶酯的混合液，称为磁分离试剂，其中磁微粒表面包被抗st2抗体1，吖啶酯标记抗st2抗体2。此外，试剂盒中还包括6种含有不同浓度st2抗原的校准品，和两种含有不同浓度st2抗原的质控品，发光底物液为氧化吖啶酯的底物液。

3、吖啶酯是吖啶盐的一个总称，指的是一类用作化学发光标记物的化学物质，吖啶酯有不同的系列，通常这类物质本底发光少，在反应中能用于检测低浓度或微量浓度的样品，是一类发光效率很高的发光剂，具有发光迅速、发光值高、检测灵敏等特点，所以受到免疫检测领域的广泛认可，正越来越多的被应用于免疫检测试剂中。

4、所述磁微粒表面基团为甲苯磺酰基，在包被过程中不需要edc等活化剂，使用磷酸盐缓冲液代替硫酸铵缓冲液，无需现配现用，操作更加简单。

5、所述磁微粒表面包被抗st2抗体1的浓缩液的制备方法是：

6、(1)配制偶联缓冲液1：0.1m的硼酸钠缓冲液，ph为9.5，2-8℃保存；

7、(2)配制偶联缓冲液2：2m磷酸钾缓冲液，ph8.5，2-8℃保存；

8、(3)配制偶联封闭液：0.2m的磷酸盐缓冲液，ph7.5，含1％牛血清白蛋白、0.1％tween20、10％蔗糖、0.2％的bronidox；

9、(4)配制洗涤、储存液：0.2m的磷酸盐缓冲液，ph7.5，含1％牛血清白蛋白、10％蔗糖(质量百分比)；

10、(5)通过涡旋振荡重悬甲苯磺酰基修饰的磁珠微球；

11、(6)将100μl甲苯磺酰基修饰的磁珠微球转移至2ml的离心管中，加入1ml的偶联缓冲液1；

12、(7)将离心管放置在磁分离器上直至磁珠微球向靠近磁铁的一侧迁移，至溶液变澄清；

13、(8)小心去除上清，避免混悬磁珠微球；

14、(9)将离心管从磁铁旁移开，通过涡旋振荡的方法将磁珠微球重悬于1ml的偶联缓冲液1中，混悬5分钟；

15、(10)重复(7)-(9)步骤3次；

16、(11)用偶联缓冲液1将磁珠定重至100μl，加入322μl的偶联缓冲液2以及400μg的st2抗体1，再使用偶联缓冲液1定重至1ml；

17、(12)充分震荡混匀后在37℃培养箱中孵育过夜，获得偶联反应体系；

18、(13)在通风厨中向步骤(12)孵育过夜后的偶联反应体系中添加5μl的乙醇胺，涡旋震荡后在涡旋混匀器上混匀30分钟终止反应；

19、(14)将离心管放置在磁分离器上直至微球向靠近磁铁的一侧迁移，至溶液变澄清；

20、(15)小心去除上清，避免混悬磁珠微球；

21、(16)将离心管从磁铁旁移开，通过涡旋振荡的方法将磁珠微球重悬于1ml的偶联缓冲液1中，混悬5分钟；

22、(17)重复(14)-(16)步骤3次；

23、(18)加入1ml偶联封闭液，在涡旋混匀器上振荡5分钟使磁珠重悬后在37℃培养箱中孵育过夜；

24、(19)将离心管放置在磁分离器上直至微球向靠近磁铁的一侧迁移，至溶液变澄清；

25、(20)小心去除上清，避免混悬磁珠微球；

26、(21)将离心管从磁铁旁移开，通过涡旋振荡的方法将磁珠微球重悬于1ml的洗涤、储存液中，混悬5分钟；

27、(22)重复(19)-(21)步骤3次，将偶联好的磁珠用洗涤、储存液定重至1ml，获得磁微粒浓缩液，保存备用，获得浓度为10mg/ml的磁微粒浓缩液，即为磁微粒表面包被抗st2抗体1的浓缩液。

28、(23)上述制备的磁微粒浓缩液的浓度为10mg/ml，反应体系1ml的技术数据，按此偶联大样(相应参数及偶联缓冲液加样量均随反应体系呈比例增加)。

29、所述吖啶酯标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白单克隆抗体技术为化学发光平台常用的偶联工艺，根据现有技术获得吖啶酯标记抗st2抗体2。

30、优选的磁分离试剂的制备：用磁分离试剂缓冲液将浓度为10mg/ml的磁微粒浓缩液稀释至1mg/ml，置于2-8℃平衡24h；加入5μg的吖啶酯标记抗st2抗体2(0.5μg/ml的吖啶酯标记抗st2抗体2，10ml反应体系，共5μg)，室温混匀0.5小时。

31、优选的，所述磁分离试剂缓冲液为ph值为5.8～8.5，缓冲液包括tris，浓度为5.98～6.52g/l；proclin-300，浓度为0.98～1.99g/l；硫柳汞，浓度为0.99～2.01g/l；氯化钠，浓度为8.5～9.5g/l；牛血清白蛋白，浓度为10～30g/l；gelatin，浓度为5～10g/l；n-乙基顺丁烯二酰亚胺，浓度为0.85～2.05g/l；tritonx-100，浓度为0.98～1.99g/l；吐温-20，浓度为0.98-1.99g/l；其余为纯化水。

32、优选的，所述磁分离试剂缓冲液ph值为7.4，缓冲液包括tris，浓度为6.05g/l；proclin-300，浓度为1.99g/l；硫柳汞，浓度为0.99g/l；氯化钠，浓度为8.98g/l；牛血清白蛋白，浓度为29.88g/l；gelatin，浓度为9.86g/l；n-乙基顺丁烯二酰亚胺，浓度为1.05g/l；tritonx-100，浓度磁分离试剂为0.98g/l；吐温-20，浓度为1.99g/l；其余为纯化水。

33、所述磁分离试剂中包含阻断剂，优选的，所述阻断剂包含hbr-2-purfied，浓度40～60μg/ml；hbr-20-purfied，浓度40～60μg/ml；hbr plus，浓度10～30μg/ml。

34、进一步优选的，所述磁分离试剂中包含hbr-2-pμrfied，浓度50μg/ml；hbr-20-pμrfied，浓度50μg/ml；hbr plμs，浓度20μg/ml。

35、传统的试剂盒中试剂组分至少包含两种，即包被在磁微粒表面的抗体1试剂组分和标记在吖啶酯上的抗体2试剂组分，两者分开放置，使用的时候要分别取样。本技术中磁分离试剂直接由两种试剂组分混合构成，使用的时候只取样一次，节省了时间，提高了样本检测通量。

36、优选的，所述校准品液系列为含有不同浓度st2抗原的稀释液。

37、优选的，所述校准品液系列的缓冲液为ph值为7.0～8.0，缓冲液组分包括pbs，浓度为0.02m；casein(酪蛋白)，浓度为10～30g/l；n-乙基顺丁烯二酰亚胺，浓度为0.85～2.05g/l；proclin-300，浓度为1.98～1.99g/l；四环素，浓度为0.98～0.99g/l；其余组分为纯化水。

38、优选的，所述校准品液系列，浓度范围为0～300ng/ml，缓冲液ph值为7.4，缓冲液组分包括pbs，浓度为0.02m；casein，浓度为20g/l；n-乙基顺丁烯二酰亚胺，浓度为1.05g/l；proclin-300，浓度为1.98g/l；四环素，浓度为0.99g/l；其余组分为纯化水。

39、优选的，所述校准品液系列的不同浓度为0ng/ml、5ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、150ng/ml、300ng/ml。

40、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

41、本发明试剂盒针对可溶性生长刺激表达基因2蛋白的检测而设计，为一种磁微粒化学发光检测试剂盒，磁分离试剂为磁微粒和吖啶酯的混合液，试剂组分仅为一种混合试剂，无试剂r1、试剂r2，大大缩减了检测时间。同时磁分离试剂的缓冲液中添加了阻断剂(hbr-2-purfied、hbr-20-purfied、hbr plus)，有效的消除了补体、嗜异性抗体等的影响，提高了样本检测准确性。另外，本发明选用表面带有甲苯磺酰基的磁微粒，无需使用edc等活化剂，不用现配现用。与现有的st2试剂盒发明专利中公布的磁微粒包被技术相比，包被过程更简化，且有利于工艺的稳定。

42、本发明中所选择的相关试剂，经实验发现，磁分离试剂中两种抗体没有非特异性交叉，能够保证检测结果的准确性，同时所选的缓冲液体系以及加入的各种物质能同时适合磁微粒和吖啶酯以及两种抗体，不影响整个体系的稳定性。

43、本发明提供的可溶性生长刺激表达基因2蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒可以与全自动化学发光分析仪联用，操作步骤极大简化，加大了检测速度和检测通量，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差。本发明的试剂盒特异性好、重复性好、使用价格更为低廉的吖啶酯发光体系代替碱性磷酸酶发光体系成本更低，检测精度高(灵敏度达到0.0055ng/ml)，反应时间短(整个反应时间由原来的30分钟降低到15分钟)、稳定性好，能很好地用于st2的检测，更能满足市场使用的综合性能需求。实施例的结果表明，本发明的试剂盒空白限为0.0055ng/ml，分析内精密度为1.34％，分析间精密度为1.16％，精密性良好。抗干扰能力强，5g/l的血红蛋白，0.5mmol/l的总胆红素、10.0g/l的脂肪乳测定均不受干扰。与上市产品的相关性良好，且试剂的稳定性良好。

44、本技术仅有一种试剂组分(除校准品、质控品、底物之外的物质)，反应模式由原来的两步法改成了一步法，减少了加样时间和孵育时间，同时吖啶酯发光体系属于闪光型，计数时间由原来的90秒降低到1～2秒内读数，检测效率高。