一种检测APC/肿瘤免疫共刺激分子的Panel的制作方法

本发明属于肿瘤体外免疫检测，涉及一种检测apc/肿瘤免疫共刺激分子的panel。

背景技术：

1、目前，癌症免疫治疗关注的主要方向为免疫检查点抑制剂疗法、过继细胞免疫疗法、肿瘤新生抗原疫苗及mrna药物。在2018年纳武单抗和派姆单抗引进国内后，意味着国内免疫治疗正式拉开序幕。但是，大多数情况下，依然只有少部分癌症患者能够从免疫治疗中获益。与此同时，部分患者在治疗过程中还产生了耐药和癌症加速进展的情况。这些可能与肿瘤细胞自身的遗传特征、肿瘤内部的侵润淋巴细胞的分布特征、抗原递呈细胞的状态等有关。

2、众所周知，适应性免疫应答是一个由多种免疫细胞和分子参与并受到严格调控及制约的过程。在癌症免疫治疗研究中，人们发现apc/肿瘤免疫共刺激分子在免疫应答的有效启动、适度效应和适时中止的过程中起着极其重要的调节作用。因此，深入了解影响癌症免疫治疗临床效果及毒副作用的apc/肿瘤免疫共刺激分子是提高免疫治疗疗效的必要前提之一。

3、有鉴于此，本发明申请人公开了一种可用于检测apc/肿瘤免疫共刺激分子的panel。本发明申请不仅丰富了现有检测apc/肿瘤免疫共刺激分子的检测技术，而且为改善癌症患者免疫治疗、提高肿瘤免疫类药物和个性化定制环状rna肿瘤免疫治疗药物的临床获益提供了践行依据。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题在于癌症患者免疫治疗过程中apc/肿瘤免疫共刺激分子检测技术的不足，提供一种可以克服上述问题或者部分地解决上述问题的用于判断癌症免疫治疗过程中免疫应答的有效启动、适度效应和适时中止情况的apc/肿瘤免疫共刺激分子检测panel，不仅可以为癌症患者的免疫治疗提供践行依据，而且也可以改善癌症患者的临床治疗质量，对免疫应答无效患者可早期进入二线治疗或个性化免疫治疗环状rna药物定制，避免不必要的免疫治疗，从而免于承受其副作用，克服目前缺少环状rna肿瘤类免疫药物疗效预测指标的问题。

2、为了达到上述目的，本发明采用技术方案的基本构思是：通过在同一癌症样本上检测多种apc/肿瘤免疫共刺激分子，确定相关癌症免疫治疗过程中免疫应答的有效启动、适度效应和适时中止情况，实现癌症患者免疫治疗过程的监控。其中，用于确定相关癌症免疫治疗过程中免疫应答的apc/肿瘤免疫共刺激分子为：cd40，cd70, gitrl, ox40l，4-1bbl, icosl, cd40l, cd27, gitr, ox40, 4-1bb，icos。

3、进一步地，所述癌症样本包括有细胞，组织，血清，血浆和培养上清。

4、进一步地，所述检测apc/肿瘤免疫共刺激分子的panel包括有捕获组分、检测组分和报告组分。

5、进一步地，所述捕获组分包括有若干自带不同强度荧光且大小均一的荧光编码基质；优选地，所述荧光编码基质包括有磁珠微球，巯基修饰的聚苯乙烯微球，羧基修饰的聚苯乙烯微球，氟基修饰的聚苯乙烯微球，羟基修饰的聚苯乙烯微球，氨基修饰的聚苯乙烯微球，巯基修饰的聚丙烯酸微球，巯基修饰的的二氧化硅微球，羧基修饰的二氧化硅微球，羟基修饰的二氧化硅微球，氨基修饰的二氧化硅微球，巯基修饰的的石墨烯微球，氟基修饰的石墨烯微球，羧基修饰的石墨烯微球，羟基修饰的石墨烯微球，氨基修饰的石墨烯微球，巯基修饰的的氮化硼微球，氟基修饰的氮化硼微球，羧基修饰的氮化硼微球，羟基修饰的氮化硼微球，氨基修饰的氮化硼微球，巯基修饰的的石墨烯纳米片，氟基修饰的石墨烯纳米片，羧基修饰的石墨烯纳米片，羟基修饰的石墨烯纳米片，氨基修饰的石墨烯纳米片，巯基修饰的的氮化硼纳米片，氟基修饰的氮化硼纳米片，羧基修饰的氮化硼纳米片，羟基修饰的氮化硼纳米片，氨基修饰的氮化硼纳米片。

6、进一步地，所述捕获组分包括有apc/肿瘤免疫共刺激分子cd40，cd70, gitrl,ox40l，4-1bbl, icosl, cd40l, cd27, gitr, ox40, 4-1bb，icos的探针分子，并固定于所述捕获组分自带荧光的基质上；所述探针分子可与检测样品中的特定物质结合；所述探针分子分别为apc/肿瘤免疫共刺激分子cd40，cd70, gitrl, ox40l，4-1bbl, icosl, cd40l,cd27, gitr, ox40, 4-1bb，icos的高度特异性捕获单克隆抗体；

7、优选地，所述高度特异性捕获单克隆抗体与所述荧光编码基质的包被比例为1微克至5微克探针分子包被1×105个荧光编码微球或1×104片荧光编码纳米片。

8、进一步地，所述检测组分包括有检测抗体混合液。所述检测抗体混合液制备的步骤如下：首先用二甲亚砜溶解生物素制备生物素/二甲亚砜溶液，随后加入待标记的apc/肿瘤免疫共刺激分子cd40，cd70, gitrl, ox40l，4-1bbl, icosl, cd40l, cd27, gitr,ox40, 4-1bb，icos的检测抗体并混匀，于37摄氏度避光孵育后，加入tris-hcl再于于37摄氏度避光孵育；随后用脱盐柱除去未反应的生物素，并进行稀释以获得生物素标记的检测抗体混合液；

9、优选地，所述检测抗体包括有鼠抗人抗体、羊抗人抗体或兔抗人抗体；

10、优选地，所述检测抗体混合液制备过程中所述检测抗体与所述生物素的摩尔比为1/10-1/15；

11、优选地，所述检测抗体混合液中制备过程中所述tris-hcl与所述生物素的体积比为0.8-1。

12、进一步地，所述报告组分包括有链霉亲和素与荧光标记染料偶联形成的报告试剂。所述报告试剂制备的步骤如下：首先用交联剂分别活化链霉亲和素和荧光标记染料，随后将活化链霉亲和素和荧光标记染料进行混合反应和纯化，并用蛋白稀释液稀释制备成浓度为1微克每毫升的报告试剂；

13、优选地，所述荧光标记染料为包括有6-羧基-x-罗丹明琥珀酰亚胺酯、5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯、四甲基罗丹明-5(6)-异硫氰酸、5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯、5-异硫氰酸荧光素尸胺、罗丹明 b 异硫氰酸酯、四甲基罗丹明-6-异硫氰酸、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、异硫氧酸荧光素、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物、罗丹明、四甲基罗丹明、香豆素、氟硼二吡咯、吲哚菁绿、cy3、cy3 .5、cy5、cy5 .5、cy7、cy7 .5、alexa fluor 594、alexafluor 488、alexa fluor 532、pe-cy5、pe-cy5.5或pe-cy7；

14、优选地，所述链霉亲和素的交联剂包括有n-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺琥珀酸酯) 、双琥珀酰亚胺酒石酸酯、（磺基琥珀酰亚胺 6-(3'-(2-吡啶基二硫代)丙酰氨基)已酸酯）、（琥珀酰亚胺 -6(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰氨基)已酸酯）；

15、优选地，所述荧光标记染料的交联剂包括有n-乙基马来酰胺、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺琥珀酸酯)）、（n-羟基磺基琥珀酰亚胺）、琥珀酰亚胺 3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯）、二硫基双马来酰亚胺乙烷。

16、进一步地，所述报告组分包括有标准品。所述标准品制备的步骤如下：首先混合apc/肿瘤免疫共刺激分子cd40，cd70, gitrl, ox40l，4-1bbl, icosl, cd40l, cd27,gitr, ox40, 4-1bb，icos的标准品制备标准品溶液,然后通过nibsc标准品对标准品溶液各个组成的浓度进行校准并用蛋白保存液稀释至终浓度10000皮克每毫升，最后通过冻干机冻干细胞因子/趋化因子的标准品溶液制成冻干粉；所述冻干粉作为标准品；所述标准品作为具有梯级浓度的所述apc/肿瘤免疫共刺激分子标准品混合液的配置原料。

17、进一步地，本发明提供了检测上述apc/肿瘤免疫共刺激分子的panel在癌症免疫治疗过程中确定免疫应答情况的应用技术方案；

18、优选地，所述应用技术方案中的apc/肿瘤免疫共刺激分子包括cd40、cd70、gitrl、ox40l、4-1bbl、icosl、cd40l、cd27、gitr、ox40、4-1bb、icos。

19、进一步地，本发明提供了检测上述apc/肿瘤免疫共刺激分子的panel在预测肿瘤免疫药物疗效中的应用技术方案；

20、优选地，所述应用技术方案中的apc/肿瘤免疫共刺激分子包括cd40、cd70、gitrl、ox40l、4-1bbl、icosl、cd40l、cd27、gitr、ox40、4-1bb、icos；

21、优选地，所述肿瘤免疫药物包括有pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂、ctla-4抑制剂、mrna药物、环状rna药物。

22、本发明人用于确定癌症免疫治疗过程中免疫应答的有效启动、适度效应和适时中止情况的apc/肿瘤免疫共刺激分子panel是通过以下技术方案来实现的：具体包括以下几个步骤：

23、第一步，在处理好的组织样本中同时标记apc/肿瘤免疫共刺激分子包括cd40、cd70、gitrl、 ox40l、4-1bbl、icosl、cd40l、cd27、gitr、ox40、4-1bb、icos；或在处理好的液体样本中依次加入apc/肿瘤免疫共刺激分子包括cd40、cd70、gitrl、 ox40l、4-1bbl、icosl、cd40l、cd27、gitr、ox40、4-1bb、icos的捕获组分，检测组分和报告试剂；

24、第二步，对第一步步骤中所述apc/肿瘤免疫共刺激分子进行颜色比对和数据采集；

25、第三步，对组织样本计算肿瘤区和非肿瘤区中各细胞类群的数量；对液体样本根据报告组分中具有梯级浓度的所述apc/肿瘤免疫共刺激分子标准品混合液确定癌症患者各细胞类群的数量。

26、进一步地，作为优选的技术方案，在上述技术方案第一步步骤中对所述apc/肿瘤免疫共刺激分子的具体操作方式如下：

27、首先，对所述组织样本标记的apc/肿瘤免疫共刺激分子分别搭配对应的特异性染料；或对液体样本中的apc/肿瘤免疫共刺激分子cd40、cd70、gitrl、 ox40l、4-1bbl、icosl、cd40l、cd27、gitr、ox40、4-1bb、icos分别搭配对应的高度特异性捕获单克隆抗体，检测抗体及荧光标记染料；

28、其次，在荧光测量系统中对每种荧光信号进行采集，让不同的apc/肿瘤免疫共刺激分子荧光信号强弱可以区分不同的细胞类群。

29、进一步地，作为优选的技术方案，在上述技术方案第二步步骤中对所述apc/肿瘤免疫共刺激分子颜色比对和采集的具体操作方式如下：

30、icos作为活化t细胞的标记；icosl为b细胞的标记；cd40为b细胞、巨噬细胞、树突状细胞的标记；cd40l为活化t细胞的标记；cd70为活化的t细胞、b细胞及成熟的树突状细胞的标记；cd27为活化的t细胞和b细胞的标记；gitrl和gitr作为活化t细胞和调节性t细胞的标记；ox40l为b细胞、树突细胞、巨噬细胞及nk细胞的标记；ox40为活化t细胞、调节性t细胞及nk细胞的标记；4-1bbl作为活化t细胞和b细胞的标记；4-1bb作为活化t细胞、b细胞、树突细胞、巨噬细胞及nk细胞的标记。

31、进一步地，作为优选的技术方案，在上述技术方案第三步步骤中的具体操作方式如下：对组织样本来说，同时监控肿瘤组织中肿瘤区和非肿瘤区中各细胞类群数量的多种免疫细胞；

32、对液体样本来说，在反应平板中每孔加入捕获组分，与平板结合后洗板，随后加入处理好的检测试样、标准品、空白样品，孵育，之后加入检测组分，孵育后洗板。再加入报告试剂，孵育，洗板后上机读取结果；或在装在流式管中处理好的检测试样中依次加入捕获组分和检测组分并混匀，孵育，之后加入报告试剂，孵育后，洗涤弃上清，再加入洗液涡旋振荡上机读取结果。

33、进一步地，一种用于检测apc/肿瘤免疫共刺激分子的panel的优选应用技术方案为肿瘤免疫药物疗效预测应用，具体如下：

34、在患者接受大剂量肿瘤免疫药物治疗4天后于第7天提取肿瘤组织或抽取外周血，对肿瘤组织或提取的血清进行panel检测，读取检测结果，如果上述apc/肿瘤免疫共刺激分子中有75%的免疫共刺激分子数量或浓度降低，可判定为免疫应答有效启动，即肿瘤免疫药物治疗有效。

35、进一步地，一种用于检测apc/肿瘤免疫共刺激分子的panel的优选应用技术方案为肿瘤免疫药物联合治疗疗效预测应用，具体如下：

36、在患者接受大剂量肿瘤免疫药物治疗4天后于第7天提取肿瘤组织或抽取外周血，对肿瘤组织或提取的血清进行panel检测，读取检测结果，如果上述apc/肿瘤免疫共刺激分子中数量或浓度降低的免疫共刺激分子比例大于25%但是小于75%，可判定为免疫应答存在适度效应，建议进行肿瘤免疫药物联合治疗。

37、进一步地，一种用于检测apc/肿瘤免疫共刺激分子的panel的优选应用技术方案为可编程环状rna肿瘤免疫药物的个体化定制，具体如下：

38、在患者接受大剂量肿瘤免疫药物治疗4天后于第7天提取肿瘤组织或抽取外周血，对肿瘤组织或提取的血清进行panel检测，读取检测结果，如果上述apc/肿瘤免疫共刺激分子中数量或浓度降低的免疫共刺激分子比例低于25%，可判定为免疫应答适时中止，即肿瘤免疫药物治疗无效，建议进行可编程环状rna肿瘤免疫药物的个体化定制治疗。

39、本发明的有益效果是：

40、第一，提供一种用于检测apc/肿瘤免疫共刺激分子的panel，克服目前癌症免疫治疗过程缺少特异性检测手段的问题，从而可以实现监控癌症免疫治疗过程中免疫应答的有效启动、适度效应和适时中止情况；

41、第二，提供上述panel在预测环状rna药物疗效中的应用，根据apc/肿瘤免疫共刺激分子浓度变化即可早期预测患者免疫治疗效果，对免疫应答无效患者可早期进入二线治疗或个性化免疫治疗环状rna药物定制，避免不必要的免疫治疗，从而免于承受其副作用，克服目前缺少环状rna肿瘤类免疫药物疗效预测指标的问题；

42、第三，相较于仅能观察一种细胞类群而无法区分各细胞亚群状态和判定各细胞类群间相互关系的传统apc/肿瘤免疫共刺激分子检测技术，本发明提供的一种检测apc/肿瘤免疫共刺激分子的panel极大提高了癌症免疫治疗过程中免疫应答的检测深度和检测可靠性，融合患者的随访信息，可为癌症患者的个性化免疫治疗用药定制及改善其临床治疗质量发挥积极作用。与此同时，本发明所提供的一种检测apc/肿瘤免疫共刺激分子的panel具有高度覆盖各免疫细胞类群和样本原位标记等特点。