一种测定动物组织中肌肽含量的方法与流程

本发明涉及含量测定，尤其涉及动物组织中肌肽含量的测定。

背景技术：

1、肌肽是一种可以在动物体内合成的由β-丙氨酸和组氨酸组成的二肽，具有很强的抗氧化能力，自由基和金属离子引起的脂质氧化具有显著的抑制作用，具有延缓细胞衰老和功能衰竭等生物学作用。还有研究报道指出肌肽能够捕捉肝毒素和酒精作用过程产生的自由基，避免出现肝硬化；以游离态存在于动物组织中具有抗炎、抗氧化和清除自由基的特性。

2、近年来，肌肽的生理活性引起了人们的广泛关注，针对肌肽的研究也逐渐深入。很多研究者需要测量动物组织中的肌肽含量用来研究肌肉代谢和品质变化规律或者通过测量不同物种之间的肌肽含量差异来间接鉴定一些肉制品中所用原料。

3、目前，肌肽含量的测定方法有液相色谱法、毛细管电泳法和液相色谱串联质谱法，但是使用液相色谱法进行测定时，因为基线较高，测定结果易受到干扰的问题，所以液相色谱法测定准确度尚需考察。而毛细管电泳法对样品分离纯化度的要求较高，成本高。而液相色谱串联质谱法在动物组织肌肽含量的测定中不管是灵敏度还是抗干扰性上都具有无可比拟的优势，但是目前研究报道中所采用的液相色谱串联质谱法均采用外标法定量，其检测结果易受基质效应和进样稳定性的干扰。可见，本领域缺乏一种低成本、简单、快速、准确测定动物组织中肌肽含量的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种内标法测定肌肽含量的方法，该方法适用于准确快速测定动物组织中的肌肽含量。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种测定动物组织中肌肽含量的方法，包括以下步骤：

4、(1)、配置肌肽标准溶液及同位素内标液；

5、(2)、制备样品溶液：将试样加入甲醇-三氯乙酸混合溶液后顺次进行均质、离心，取上清液加入乙腈-水的混合溶液和同位素内标液混匀，经滤膜过滤后进样测定；

6、(3)、使用液相色谱-串联质谱仪测定肌肽含量；

7、所述液相色谱-串联质谱仪在测定肌肽含量时，以含0.08％～0.12％体积浓度甲酸的水溶液为流动相a，乙腈作为流动相b，液相色谱检测的洗脱条件如下：

8、在＜0.5min范围内，19％～21％流动相a，81％～79％流动相b；

9、在≥0.5min且＜3.0min范围内，20％→50％流动相a，80％→50％流动相b；

10、在≥3.0min且＜5.0min范围内，50％流动相a，50％流动相b；

11、在≥5.0min且＜5.1min范围内，50％→20％流动相a，50％→80％流动相b；

12、在≥5.1min且≤7.0min范围内，20％流动相a，80％流动相b；

13、质谱部分的检测条件为：

14、电喷雾化学电离源esi，采用多反应监测模式，离子源温度为349℃～351℃，毛细管温度为239℃～241℃，加热模块温度为299℃～301℃，氮气流速2.9l/min～3.1l/min，干燥气流速9.9l/min～10.1l/min，加热气流速9.9l/min～10.1l/min。

15、优选的，所述液相色谱-串联质谱仪在测定肌肽含量时，以含0.1％体积浓度甲酸的水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，液相色谱检测的洗脱条件如下：

16、在＜0.5min范围内，20％流动相a，80％流动相b；

17、在≥0.5min且＜3.0min范围内，20％→50％流动相a，80％→50％流动相b；

18、在≥3.0min且＜5.0min范围内，50％流动相a，50％流动相b；

19、在≥5.0min且＜5.1min范围内，50％→20％流动相a，50％→80％流动相b；

20、在≥5.1min且≤7.0min范围内，20％流动相a，80％流动相b；

21、质谱部分的检测条件为：

22、电喷雾化学电离源esi，采用多反应监测模式，离子源温度为350℃，毛细管温度为240℃，加热模块温度为300℃，氮气流速3.0l/min，干燥气流速10.0l/min，加热气流速10.0l/min。

23、优选的，所述甲醇-三氯乙酸混合溶液由甲醇和体积浓度为2％的三氯乙酸以1:0.9～1.1的体积比混合而成；

24、所述乙腈-水的混合溶液由乙腈与水以0.9～1.1：1的体积比混合而成；

25、所述试样加入甲醇-三氯乙酸混合溶液时，试样与甲醇-三氯乙酸混合溶液的比例为1g：9.9ml～10.1ml，所述上清液与乙腈-水混合溶液及同位素内标液的体积比为1：88～90：9～11。

26、优选的，所述甲醇-三氯乙酸混合溶液由甲醇和体积浓度为2％的三氯乙酸以1：1的体积比混合而成；

27、所述乙腈-水的混合溶液由乙腈与水以1：1的体积比混合而成；

28、所述试样加入甲醇-三氯乙酸混合溶液时，试样与甲醇-三氯乙酸混合溶液的比例为1g：10ml，所述上清液与乙腈-水混合溶液及同位素内标液的体积比为1：89：10。

29、优选的，所述同位素内标液为1μg/ml的d4-肌肽溶液；

30、所述肌肽标准溶液中肌肽浓度为1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml的系列肌肽标准溶液；

31、所述肌肽标准工作溶液中，d4-肌肽的浓度为100ng/ml。

32、优选的，所述肌肽标准溶液需要先使用水配置出1mg/ml的肌肽标准储备液并继续用水稀释得到10μg/ml的肌肽标准中间工作液，再使用乙腈-水的混合溶液稀释得到；

33、所述同位素内标液需要先使用水配置出d4-肌肽浓度为100μg/ml的内标标准储备液，再使用水稀释得到d4-肌肽浓度为1μg/ml的同位素内标液。

34、优选的，过滤使用的滤膜为0.21μl～0.23μl。

35、优选的，过滤使用的滤膜为0.22μl。

36、优选的，步骤(2)所述均质时间为0.5min～1.5min；所述离心，其离心速度为9000r/min～11000r/min，离心时间为4min～6min。

37、优选的，液相色谱使用的色谱柱为waters acquity beh amide柱，2.1mm×100mm，1.7μm。

38、肌肽(l-carnosine)，学名β-丙氨酰-l-组氨酸，是一种由β-丙氨酸和l-组氨酸两种氨基酸组成的二肽，其结构式为：

39、

40、本发明使用甲醇与三氯乙酸的混合溶液作为样品前处理过程的提取溶液，使用同位素内标法定量，以超高效液相色谱-四极杆串联质谱联用方法建立了动物组织中肌肽含量的检测方法。

41、因为肌肽易溶于水不易溶于有机溶剂，现有技术中多采用水作为提取溶液，但在实验过程中发现，使用水作为肌肽提取溶液时，虽然提取效果较好，但其前处理过长时，在大批量处理样品时，肌肽在基质提取液中存在一定降解现象。为保证检测数据的稳定性，本发明对提取溶液进行了优化，最终选取甲醇与三氯乙酸的混合溶液作为样品前处理过程的提取溶液。

42、与外标法相比，内标法将一定重量的纯物质作为内标物加到一定量的被分析样品混合物中，消除了操作条件的波动对分析结果产生的影响，准确度更高。

43、在色谱中，流动相的种类及比例影响着待测组分的分离机色谱图基线形状，选择合适的流动相，使色谱峰响应度更好，会对检测准确度及灵敏性产生影响。本发明选择乙腈和甲酸作为流动相，获得更好的色谱峰形及更高的准确度。

44、综上所述，本发明所述方法的前处理条件简单，还具有灵敏度高，定量准确的特点，为动物组织中肌肽含量的准确测定提供了新的参考技术手段