一种用于检测Ag+的试剂及其在C反应蛋白检测中的应用

本发明属于生物分析化学领域，具体涉及一种用于检测ag+的试剂及其在c反应蛋白检测中的应用。

背景技术：

1、c-反应蛋白(c-reactive protein，crp)是由肝脏产生的能与多种病原体的多糖产生反应的急性时相反应蛋白，crp在健康人血清中浓度很低(90％正常人<1.0μg/ml)，在急性心肌梗死、创伤、感染、炎症、外科手术、肿瘤浸润等情况下，其血液浓度急剧升高。crp是细菌感染的敏感指标，也是鉴别细菌感染或病毒感染最有效的指标。近年来，随着研究的进一步深入，发现血清超敏crp(hs-crp)浓度升高(0.1-3μg/ml)与冠心病和周围血管病变密切相关，其预测价值高于传统的冠心病危险因素。hs-crp作为炎症标志物及动脉粥样硬化、血栓形成疾病的标志物在心血管疾病诊治中越来越受到重视。

2、目前报道的检测crp的方法有电化学发光法、荧光法、化学发光法、表面等离子体共振法等，但是存在着检测时间长、灵敏度不够高等缺点。且crp是急性时相反应蛋白，样本放置时间越长，crp降解越多，因此，建立一种简单、快速、灵敏和准确的测定crp的新方法，对于临床疾病诊断和疗效监测具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于检测ag+的试剂。

2、本发明还提出一种检测ag+的方法。

3、本发明还提出一种c反应蛋白的检测试剂。

4、本发明还提出一种c反应蛋白的检测试剂盒。

5、本发明还提出上述检测试剂或试剂盒的应用。

6、本发明还提出一种c反应蛋白的检测方法。根据本发明的一个方面，提出了一种用于检测ag+的试剂，所述试剂包括纳米金(aunps)。

7、在本发明的一些实施方式中，所述aunps的终浓度为0-350pm。

8、在本发明的一些实施方式中，所述aunps的终浓度为175pm。

9、在本发明的一些实施方式中，所述试剂还包括吸附载体、胶体保护剂、吸附指示剂、ph调节剂和掩蔽剂。

10、在本发明的一些实施方式中，所述吸附载体包括卤化银沉淀。

11、在本发明的一些实施方式中，所述卤化银沉淀包括agcl、agbr和agi中的一种。

12、在本发明的一些实施方式中，所述吸附载体的终浓度为0-20mg/ml。

13、在本发明的一些实施方式中，所述吸附载体的终浓度为11.65mg/ml。

14、在本发明的一些实施方式中，所述胶体保护剂为淀粉。

15、在本发明的一些实施方式中，所述胶体保护剂的终浓度为0-1.0％。

16、在本发明的一些实施方式中，所述胶体保护剂的终浓度为0.5％。

17、在本发明的一些实施方式中，所述吸附指示剂包括曙红或荧光黄。

18、在本发明的一些实施方式中，所述吸附指示剂的终浓度为0-18μm。

19、在本发明的一些实施方式中，所述吸附指示剂的终浓度为15μm。

20、在本发明的一些实施方式中，所述ph调节剂为hno3。

21、在本发明的一些实施方式中，所述ph调节剂为hno3的终浓度为0-6.34mm。

22、在本发明的一些实施方式中，所述ph调节剂为hno3的终浓度为6.18mm。

23、在本发明的一些实施方式中，所述掩蔽剂包括hg2+、柠檬酸钠和bsa。

24、在本发明的一些实施方式中，所述掩蔽剂包括终浓度为0-280nm的hg2+、0-10nm的柠檬酸钠和0-200ng/ml的bsa。

25、在本发明的一些实施方式中，所述掩蔽剂包括终浓度为240nm的hg2+、5nm的柠檬酸钠和80ng/ml的bsa。

26、根据本发明的第二方面，提出了一种检测ag+的方法，所述方法包括以下步骤：采用上述试剂进行检测。

27、根据本发明的第三方面，提出了一种c反应蛋白的检测试剂，所述检测试剂包括上述用于ag+检测的试剂和核酸适配体。

28、在本发明的一些实施方式中，所述核酸适配体的核苷酸序列如seq id no.1所示。

29、在本发明的一些实施方式中，所述核酸适配体具有发夹结构。

30、在本发明的一些实施方式中，所述发夹结构的制备方法包括：通过在含有核酸适配体的溶液中添加金属离子，即得。本发明添加ag+的目的是使得核酸适配体c碱基之间发生错配。

31、在本发明的一些实施方式中，所述ag+的浓度为0.1nm。

32、在本发明的一些实施方式中，所述溶液中还包括缓冲液。

33、在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液为mops缓冲液或hepes缓冲液。

34、在本发明的一些实施方式中，所述mops的浓度为10mm，ph为7.6。

35、在本发明的一些实施方式中，所述mops缓冲液含有nano3和mg(no3)2。

36、在本发明的一些实施方式中，所述mops缓冲液中nano3浓度为100mm。

37、在本发明的一些实施方式中，所述mops缓冲液中mg(no3)2的浓度为2.5mm。

38、在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液为hepes缓冲液。

39、在本发明的一些实施方式中，所述hepes缓冲液的浓度为20mm，ph为7.35。

40、在本发明的一些实施方式中，所述hepes缓冲液含nano3、mg(no3)2、kno3和ca(no3)2。

41、在本发明的一些实施方式中，所述nano3浓度为120mm，mg(no3)2的浓度为0.1mm，kno3浓度为5mm，ca(no3)2的浓度是0.1mm。

42、在本发明的一些实施方式中，所述核酸适配体的浓度为0.5-5μm。

43、在本发明的一些实施方式中，所述核酸适配体的浓度为1μm。

44、根据本发明的第四方面，提出了一种用于检测c反应蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含上述c反应蛋白检测方法所用试剂。

45、根据本发明的第五方面，提出了c反应蛋白检测方法和上述试剂盒的应用，所述应用为在检测c反应蛋白中的应用。

46、在本发明的第六方面，提出了一种c反应蛋白的检测方法，所述方法包括以下步骤：采用上述c反应蛋白检测试剂或上述试剂盒进行检测即得。

47、在本发明的一些实施方式中，所述检测在激发波长308-365nm，发射波长450-600nm的条件下进行。

48、在本发明的一些实施方式中，所述检测采用酶标仪进行检测。

49、根据本发明的一些的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明方案通过添加aunps，使得ag+的检测限提高了955倍；且在用于ag+检测的试剂中通过添加核酸适配体(含ag+诱导的c-c错配的碱基对)，用于c反应蛋白检测，对c反应蛋白具有超高的灵敏度和特异性，可以实现浓度低至2pg/ml的crp检测，具有进一步应用于其他血液中低浓度疾病标志物检测的潜力。本发明的c反应蛋白检测方法是通过曙红、ag+、适配子和aunps联用实现的，人血清中crp含量与溶液中曙红的荧光强度降低值间呈良好的线性相关(r＝0.9969)，并且线性范围宽，在万分之一血清基体中检测范围为0.01-40ng/ml(相当于血清中crp 0.1-400μg/ml)，检测限2pg/ml(血清中为0.02μg/ml)，方法重现性较好，准确度高(在人血清中回收率为90-107％)，特异性良好。此外，本方法适用于临床样本检测，与乳胶增强免疫浊度法检测结果间相关性好(r＝0.986)，所需试剂和样品少、不需要生物抗体成本低、灵敏度高，可在37min实现血清样本中crp的检测，且易于实现工业化和自动化，可实现大量样本的同时检测。