黄连膏HPLC指纹图谱的构建及多成分含量测定方法

本发明涉及中药质量检测，尤其涉及一种黄连膏hplc指纹图谱的构建及含量测定方法。

背景技术：

1、黄连膏由黄连、黄柏、姜黄、当归(尾)和生地黄五味药材组成，始载于中医最早的外科学专著《刘涓子鬼遗方》，以清利湿热为组方原则，遵循“外治之理即内治之理”的原则，药力可直达病所，苦寒清热以泻肌肤热毒，收湿敛疮促进吸收。方中黄连清热燥湿，黄柏泻火解毒，姜黄破血行气，当归(尾)活血养血，生地黄清热生津、凉血养阴润燥。黄连膏主要用于清热疖肿，清热解毒，溃疡创伤。治疗肺经壅热，上攻鼻窍，致生鼻疮，干燥肿疼。黄连膏从古至今已有1500多年的应用历史，是全国各地中医医院重要的外用制剂，但现有黄连膏品种在色泽、性状等方面存在显著差异，无法保证稳定可靠的临床疗效。因此，其现代化质控技术的开发对于推进黄连膏产业发展具有重要意义。

2、指纹图谱技术作为中药质量控制的一种综合的、可量化的重要分析手段而被广泛应用，具有信息量大、特征性强的特点，能够有效的、全面的、科学的反映中药材及中药制剂的质量的真实性、稳定性和均一性。同时，高效液相色谱法(hplc)具有分离效能高，分析速度快，检测灵敏度高，应用范围广等特点。不受样品挥发性和热稳定性的限制，绝大多数中药成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测。因此，高效液相色谱法已成为构建中药指纹图谱的首选方法。

3、目前，关于黄连膏的质量评价研究文献较少，存在难以全面控制药物质量的问题。因此，为了更全面的、有效的控制黄连膏的质量，提高其质量控制水平，满足临床用药安全、疗效可靠，很有必要建立一种能够科学、准确、全面评价黄连膏质量的现代化质控方法。本发明提供的黄连膏hplc指纹图谱和多成分的质量控制方法，具有良好的准确性、稳定性和重复性，能够有效地控制黄连膏的质量，可以应用于大工业生产中。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，针对现有技术提出的问题，本发明提供一种黄连膏hplc指纹图谱的构建及多成分含量测定方法，该方法采用waters sunfire c18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.3％磷酸溶液为流动相b，进行梯度洗脱，建立16批黄连膏样品的hplc指纹图谱及其6种主要成分的含量，应用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行相似度评价，建立了黄连膏的hplc指纹图谱并确定了17个共有峰，16批样品的相似度均大于0.9，通过本发明所述方法建立的黄连膏hplc指纹图谱方法特征性强，含量测定方法准确可靠，重复性好，可为其质量评价提供参考，可对黄连膏样品整体成分的信息特征进行较为全面的反映，为其质量控制提供了更为科学合理的理论支持，可以应用于大工业生产中。

2、本发明所述的一种黄连膏hplc指纹图谱的构建方法，按下列步骤进行：

3、a、取黄连膏样品精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，密塞，称定重量，温度55℃±5℃，超声处理30分钟，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，放置至甲醇层澄清，分取甲醇层，离心力15,000g，温度4℃离心15min，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

4、b、取5-羟甲基糠醛、阿魏酸、盐酸小檗碱、洋川芎内酯i、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素、芝麻素、藁本内酯、芝麻林素对照品，加甲醇制成每1ml分别含20μg、42μg、57μg、53μg、10μg、22μg、24μg、80μg、96μg、60μg的溶液，即得第一混合对照品溶液；

5、c、将步骤a中的供试品溶液和步骤b中的第一混合对照品溶液注入高效液相色谱仪中，色谱条件：以waters sunfire c18 250mm×4.6mm,5μm为色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.3％磷酸溶液为流动相b，按时间0-5min，流动相a10-20％；5-23min，流动相a 20-25％；23-26min，流动相a 25-50％；26-46min，流动相a 50-60％；46-51min，流动相a 60-65％；51-56min，流动相a 65％；56-63min流动相a 65-70％；63-70min，流动相a 70-80％进行梯度洗脱；柱温为25℃；流速为1.0ml/min；进样体积为10μl，检测波长为260nm，得到黄连膏hplc指纹图谱，以姜黄素色谱峰为参照峰s，检测得到的黄连膏hplc指纹图谱在260nm处有17个共有峰。

6、所述黄连膏hplc指纹图谱构建的多成分含量测定方法，该方法是对黄连膏中5-羟甲基糠醛、阿魏酸、盐酸小檗碱、洋川芎内酯i、姜黄素、藁本内酯含量测定，具体操作按下列步骤进行：

7、a、取黄连膏样品精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，密塞，称定重量，温度55℃±5℃，超声处理30分钟，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，放置至甲醇层澄清，分取甲醇层，离心力15,000g，温度4℃离心15min，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

8、b、取5-羟甲基糠醛、阿魏酸、盐酸小檗碱、洋川芎内酯i、姜黄素、藁本内酯对照品，加甲醇制成每1ml分别含22μg、2μg、26μg、2μg、70μg、30μg的溶液，即得第二混合对照品溶液；

9、c、分别吸取供试品溶液和第二混合对照品溶液注入高效液相色谱仪中，色谱条件：以waters sunfire c18 250mm×4.6mm,5μm为色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.3％磷酸溶液为流动相b，按时间0-5min，流动相a10-20％；5-23min，流动相a 20-25％；23-26min，流动相a 25-50％；26-46min，流动相a 50-60％；46-51min，流动相a 60-65％；51-56min，流动相a 65％；56-63min，流动相a 65-70％；63-70min，流动相a 70-80％进行梯度洗脱；柱温为25℃，流速为1.0ml/min，进样体积为10μl，检测波长分别为5-羟甲基糠醛和洋川芎内酯i280nm，盐酸小檗碱260nm，阿魏酸和藁本内酯321nm，姜黄素430nm；

10、d、通过线性回归方程计算得到5-羟甲基糠醛的含量为0.019-0.067mg/g；洋川芎内酯i的含量为0.008-0.014mg/g；盐酸小檗碱的含量为0.050-0.149mg/g；阿魏酸的含量为0.007-0.010mg/g；藁本内酯的含量为0.091-0.141mg/g；姜黄素的含量为0.071-0.268mg/g。

11、本发明所述的黄连膏hplc指纹图谱的构建及多成分含量测定方法，该方法具有以下有益效果：

12、1、本发明采用waters sunfire c18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.3％磷酸溶液为流动相b，进行梯度洗脱，建立16批样品的hplc指纹图谱及其6种主要成分的含量，应用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行相似度评价，建立了黄连膏的hplc指纹图谱并确定了17个共有峰，16批样品的相似度均大于0.9；该方法建立的黄连膏hplc指纹图谱方法特征性强，出峰强度、数目及共有峰的整体分离度等色谱信息均较好，且精密度高、重复性好，可为其质量评价提供参考，可对黄连膏样品整体成分的信息特征进行较为全面的反映，为其质量控制提供了更为科学合理的理论支持，可以应用于大工业生产中，是非常好的质量控制方法。

13、2、本发明建立了黄连膏的hplc指纹图谱，并对黄连膏中5-羟甲基糠醛、阿魏酸、盐酸小檗碱、洋川芎内酯i、姜黄素、藁本内酯进行了多成分含量测定，测定得到5-羟甲基糠醛含量为0.019mg/g-0.067mg/g、阿魏酸含量为0.007mg/g-0.010mg/g、盐酸小檗碱含量为0.050mg/g-0.149mg/g、洋川芎内酯i含量为0.008mg/g-0.014mg/g、姜黄素含量为0.091mg/g-0.141mg/g、藁本内酯的含量为0.071mg/g-0.268mg/g。