一种组织样品制备装置及其应用

本发明涉及一种组织样品制备装置及其应用，属于生物分析与检测。

背景技术：

1、由于细胞作为机体的基本单元，在特定的空间位置与微环境协同，发挥其特有的生物学功能，对于研究和理解细胞生物学、肿瘤生物学、发育生物学等学科的发生机制来说，空间位置信息尤为重要[胡波等,海马位置细胞空间信息处理机制的研究进展[j].中华神经医学杂志,2005(04):416-418.]。显微成像（包括超分辨率和单分子成像）、多重荧光原位杂交等技术的发展加深了我们对细胞、组织结构和功能的理解；测序技术使得我们能够对未知的细胞或组织中基因的表达情况进行定量和定性分析。自2020年，空间组学（spatial omics）技术被nature methods评为年度技术方法之后，2022年上榜nature年度值得关注的七大榜单技术。空间转录组（spatial transcriptome）技术可以同时获得细胞的空间位置信息和基因表达数据，推进了对组织原位细胞真实基因表达的研究，为组织细胞功能、微环境互作、发育过程谱系追踪、疾病病理学等多个领域提供了重要的研究手段[危莹等,空间转录组技术研究进展[j].生物化学与生物物理进展,2022,49(03):561-571.]。而以蛋白质空间定位为研究方向的空间蛋白质组学现在已经用于揭示人类蛋白质组的复杂结构，包括单细胞变异（在蛋白质水平和定位上）、动态蛋白质易位、改变相互作用网络和多个区室的蛋白质定位。目前已经达到了空间蛋白质组学最终与其他“组学”技术相结合的地步，从而为生物过程提供无偏见的系统层面的见解。

2、基于质谱技术的蛋白质组学高通量药物筛选是一种非常有前景的技术，因为蛋白质组学可以提供更加全面的信息（蛋白质定性、定量以及翻译后修饰），提高药物发现的成功概率[吴琼等,高通量蛋白质组学分析研究进展[j].色谱,2021,39(02):112-117.]。基于成像的空间蛋白质组学提供了在自然细胞环境下可视化研究蛋白质的机会，而不需要在蛋白质组学分析之前进行细胞裂解或细胞器的分离。此技术可以在亚细胞分辨率下为单个细胞提供富有成效的表型状态的新读数，这可能有助于揭示非遗传细胞异质性在肿瘤发生和耐药性中的作用[gnann c, et al. illuminating non-genetic cellularheterogeneity with imaging-based spatial proteomics. trends cancer. 2021 apr;7(4):278-282.]。基于成像的蛋白质组学定位便于研究具有多模式细胞器定位的蛋白质，实际上大多数的蛋白质也是定位于多个亚细胞区室的。基于质谱与成像的空间蛋白质组学有助于全面了解细胞的复杂性，而且空间蛋白质组学与其他组学的结合，也将有利于发现更多的生物学信息。目前大多数蛋白质组学技术的发展主要致力于提高方法的灵敏度、数据采集速度、定性定量的准确度，但是样品的前处理方式也是困扰研究的关键限速步骤。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种组织样品制备装置及其应用，该装置制备的组织样品可以在获得组织表型图像及成分分布的同时，保留精确的空间蛋白质组学或者空间转录组学信息，显著提高蛋白质组学以及转录组学技术等在生物标志物的研发、临床样品的分析和靶向药物的筛选中的应用潜力。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种组织样品制备装置，包括由上到下依次设置的上层顶板、中层夹板、下层针板、样品板和底架；

4、所述底架上设置有与样品板匹配的下沉槽，所述中层夹板、下层针板、样品板上分别设置有相互对应的第一通孔、第二通孔、样品孔；

5、所述第二通孔上端设置有与第一通孔匹配的切割环，所述第二通孔下端设置有与样品孔匹配的导向环；

6、所述切割环的高度大于第一通孔的深度。

7、本装置中，所述切割环以穿过第一通孔的方式与第一通孔匹配，所述导向环以部分插入样品孔的方式与样品孔匹配。

8、根据本发明优选的，所述底架为亚克力板，所述下沉槽的深度为2~3mm。本装置中，所述样品板以嵌入下沉槽内的方式与下沉槽匹配，下沉槽主要用于固定样品板，也可采用其他方式将样品板固定于底板上。

9、根据本发明优选的，还包括导向柱，所述导向柱竖直设置在底架外侧，所述上层顶板、中层夹板、下层针板设置有与导向柱匹配的通孔，所述上层顶板、中层夹板、下层针板自上往下依次套设在导向柱上。

10、进一步优选的，所述导向柱为亚克力柱或不锈钢金属柱，直径为0.5cm-0.8cm，高度为5-8cm。

11、根据本发明优选的，还包括弹簧，所述下层针板和底架之间设置有弹簧，所述弹簧套设在导向柱上。本装置中设有弹簧，一方面为导向环与样品孔之间的接触提供缓冲，另一方面为切割环提供向上的弹压力。

12、根据本发明优选的，还包括压力施加装置，所述压力施加装置施加压力于上层顶板上。

13、根据本发明优选的，所述样品板为384孔板。本装置中使用的384孔板即为maldi质谱仪器对应使用的384孔板，所述384孔板上样品孔的孔口孔径为3.0-3.2mm。

14、根据本发明优选的，所述上层顶板为亚克力板，厚度为2-3cm。

15、根据本发明优选的，所述中层夹板为亚克力板，厚度为0.5cm-1cm。本装置中，为与384孔板的样品孔相匹配，所述第一通孔的孔径可与384孔板的孔口直径相同，设为3.0mm-3.2mm。

16、根据本发明优选的，所述下层针板为亚克力板，厚度为0.5cm-1cm，所述切割环和导向环的环宽为0.1-0.2mm，所述切割环的高度大于第一通孔的深度0.1-0.3mm，所述导向环的高度为0.5-0.7mm。本装置中，为与384孔板相匹配，所述切割环和导向环的外直径小于384孔板的孔口直径，可设为2.7-2.9mm。

17、上述组织样品制备装置的使用方法，包括如下步骤：

18、将制备好的组织切片放置于上层顶板和中层夹板之间，使用压力施加装置施加压力于上层顶板上，在施加了压力的作用下，上层顶板、中层夹板、下层针板和样品板之间相互挤压，其中，切割环穿过第一通孔，直接接触到组织切片，并对组织切片进行原位切割，切割得到的组织通过导向环导入到对应的样品孔中，完成组织样品的制备，并保留了组织样品的时空信息。

19、本装置中，中层夹板与上层顶板配合，能够固定组织切片，使组织切片受力均匀，还可以防止组织切片贴附于上层顶板，影响切割效果。

20、本装置中，下层针板上设有切割环和导向环，切割环直接与组织切片接触进行组织切割，切割时的作用力主要来自压力施加装置施加于上层顶板上的力，以及弹簧提供的弹压力，切割后得到的组织通过导向环导入到样品孔中。一般情况下，压力施加装置施加的压力约为8~10n。

21、本装置中，中层夹板的第一通孔和下层针板的第二通孔均与样品孔一一对应，可以保证切割得到的组织可以均匀落于样品孔中。

22、上述组织样品制备装置在制备空间组学组织样品中的应用。

23、上述组织样品制备装置在组织样品空间组学检测中的应用。

24、上述组织样品制备装置在组织样品空间多组学联合检测中的应用。

25、采用上述组织样品制备装置制备组织样品，可用于质谱成像，解析样品板上组织样品的小分子代谢物；也可将制备的组织样品进行蛋白质组学分析，分别通过蛋白提取、胰酶酶切、脱盐、冻干、质谱上机检测、生物信息学分析，获得蛋白质定量分析结果；还可以将制备的组织样品进行转录组学分析，组织样品进行总rna的提取、mrna分离、片段化、逆转录成cdna、cdna第一链合成、cdna二链合成、纯化双链cdna、pcr扩增纯化、文库质检、上机测序，从而获得组织样品的rna定量数据。综合上述质谱成像结合蛋白质组学以及转录组学分析，不仅可以得到组织样品特定位置的小分子代谢物，而且可以得到该对应位置的蛋白质和rna定量信息，以同一位置获得大分子蛋白质、小分子代谢物及其rna等综合信息进行下一步分析，以达到多组学联合应用的目的。

26、上述组织样品制备装置在检测生物标志物中的应用。

27、本发明中，应用该组织样品制备装置分析正常动物组织样品和某种疾病动物的病理组织样品，或者临床健康人的生理组织样品和某种疾病患者的病理组织样品，建立数据库，通过比对正常动物（或健康人）和某种疾病动物（或患者）的分子、蛋白质及基因图谱来寻找差异，寻找特征分子、蛋白质或者基因，发现生物标志物。

28、本发明的有益效果：

29、1、本发明开发了一种组织样品制备装置，其中，中层夹板、下层针板、样品板上分别设置有相互对应的第一通孔、第二通孔、样品孔，所述第二通孔上端设置有与第一通孔匹配的切割环，所述第二通孔下端设置有与样品孔匹配的导向环，所述切割环高度大于第一通孔的深度。在制备组织样品时，将组织切片置于上层顶板与中层夹板之间，向上层顶板施加压力，上层顶板、中层夹板、下层针板和样品板之间相互挤压，其中，切割环可以穿过第一通孔直接接触到组织切片，并对组织切片进行原位切割，切割得到的组织通过导向环导入到对应的样品孔中，完成组织样品的制备，并保留了组织样品的时空信息。在空间组学分析中，384孔板由于样品制备通量较高，在蛋白质组学、转录组学等多组学研究中起到越来越重要的作用。本发明优选的，是基于384孔板设计了相应的组织样品制备装置，在384孔板质谱组学分析技术的基础上改进优化的，因此，本发明所述的384孔板与质谱组学分析的标准384孔板一致，具有较高的分辨度及空间能力。

30、2、使用本发明的组织样品制备装置可有效且高效的制备组织样品，并保留组织样品的空间位置，该装置结合质谱成像、蛋白质组学、转录组学、测序及pcr等技术，可在同一位置同时观察到分子、蛋白质和基因信息，比现有的空间蛋白质组学或者空间转录组学等的样品制备方法，更加快速，制备成本更低。

31、3、本发明利用亚克力板作为组织样品制备装置的材料，由于亚克力是用无色透明的有机玻璃制成，透光率可以达到95%以上，且耐气候性强，韧性好，不易破损，在装置使用过程中可以最大程度保证它的透明性及韧性，保证在组织样品制备及提取过程中，能够分辨对应的孔位及组织体积。

32、4、本发明采用组织样品制备装置制备的组织样品中，384孔板中每一个样品孔（spot）都是一个检测区，使用蛋白纯化分离、测序和pcr（聚合酶链反应）直接检测组织样品，通过质谱成像得到不同区域位置的可视化特定化学成分的空间分布，结合转录组学或者蛋白质组学的技术，可以得到全面的具有空间信息的化学成分、蛋白质以及基因的综合信息。采用本发明的组织样品制备装置制备组织样品进行组学分析，具有快速、高灵敏度、低成本、所需样品量少、位置精确等特点，使得同一位置同时观察到分子、蛋白质和基因成为可能。

33、5、本发明组织样品制备装置进行多组学联合应用，可同时检测大分子和小分子，并且在其对应位置进行关联分析，使其在同一位置多种角度看到不同物质。

34、6、本发明组织样品制备装置实际应用于病理学、免疫学、神经科学和肿瘤学等，可以多维度地了解疾病的分子机制，广泛用于分析组织或类器官的分子空间结构，在临床和生物学研究中创建生物分子图谱。