一种卡泊三醇有关物质的高效液相色谱分析法的制作方法

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种卡泊三醇有关物质的高效液相色谱分析法。

背景技术：

1、卡泊三醇(calcipotriol)又名钙泊三醇，化学名为：(5z,7e,22e,24s)-24-环丙基-9,10-开环胆甾-5,7,10(19),22-四烯-1α,3β,24-三醇。属于活性型维生素d3制剂，具有抑制dna合成、抑制细胞增殖作用，主要用于治疗寻常性银屑病(俗称牛皮癣)。结构式如下：

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3、卡泊三醇是维生素d的衍生物，与细胞表面vd3受体结合调控细胞内dna和角蛋白合成，能抑制皮肤细胞(角朊细胞)的过度增生和诱导其分化，从而使银屑病皮肤细胞的增生及分化异常得以纠正，与维生素d受体亲和力与骨化三醇相近，但对钙代谢的影响不足骨化三醇的1％，可长期服用，副作用小；同时卡泊三醇可调节细胞炎性因子的释放，抑制炎性浸润和增生，起到抗炎作用，并通过抑制t淋巴细胞功能和中性粒细胞聚集来发挥治疗作用，卡泊三醇是目前治疗局限性银屑病最有效的非糖皮质激素外用药之一。

4、在卡泊三醇原料药的合成工艺中不可避免的会产生一些副产物杂质，比如杂质k、杂质l和杂质m(结构式见下图所示)，这些卡泊三醇中的副产物杂质会直接影响对卡泊三醇的质量控制，从而影响卡泊三醇制剂的治疗效果。

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6、卡泊三醇合成步骤复杂、结构不稳定、光学异构体及副产物较多，导致杂质分离难度大，鉴于国内外现有的卡泊三醇质量标准(ep11、usp-nf2022、bp2023药典)中并没有提出相关检测杂质k、杂质l和杂质m的分离分析方法，且也没有任何相关的文献报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种卡泊三醇有关物质的高效液相色谱分析法。本发明旨在建立一种能简单、快速、同时分离分析卡泊三醇及其多个副产物杂质的高效液相色谱法。

2、实现上述发明目的的技术方案是：

3、本发明提供一种卡泊三醇有关物质的高效液相色谱分析法，所述方法能够分离卡泊三醇中的有关物质，各色谱峰之间的分离度不小于1.5；

4、所述方法色谱条件设置为：

5、色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶kromasil 100-5-c8，规格为4.6mm×250mm,5μm；

6、流动相：以水为流动相a，乙腈为流动相b进行梯度洗脱；

7、检测波长：260～270nm；

8、柱温：30～40℃；

9、流速：1～2ml/min；

10、进样量：10～20μl。

11、根据本发明实施方案，所述有关物质包括杂质k、杂质l、杂质m，其中，杂质结构式如下：

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13、

14、根据本发明实施方案，所述流动相是以水为流动相a，乙腈为流动相b按下表进行梯度洗脱：

15、 时间(分钟) 流动相a(％) 流动相b(％) 0 60 40 30 50 50 32 25 75 57 15 85 58 60 40 65 60 40

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17、根据本发明实施方案，所述柱温可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃；优选为35℃。

18、根据本发明实施方案，所述流速可以是1ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min、1.3ml/min、1.4ml/min、1.5ml/min、1.6ml/min、1.7ml/min、1.8ml/min、1.9ml/min、2.0ml/min；优选为1.5ml/min。

19、根据本发明实施方案，所述进样体积为10μl、11μl、12μl、13μl、14μl、15μl、16μl、17μl、18μl、19μl、20μl；优选为20μl。

20、根据本发明实施方案，所述波长为260nm、261nm、262nm、263nm、264nm、265nm、266nm、267nm、268nm、269nm、270nm；优选为264nm。

21、根据本发明优选实施方案，一种卡泊三醇有关物质的高效液相色谱分析法，包括以下步骤：

22、(1)样品配制：

23、供试品溶液制备：取本品适量，精密称定，置量瓶中，加20％量瓶体积的甲醇振摇使溶解，用稀释剂定量稀释制成每1ml中约含0.4mg的溶液，摇匀，即得；

24、对照溶液制备：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀；再精密量取1ml，置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；

25、各杂质贮备液：取杂质k、杂质l及杂质m各适量，置不同的量瓶中，加甲醇振摇使溶解并定量稀释制成每1ml中各约含0.2mg的溶液，摇匀，分别作为各杂质贮备液；

26、系统适用性溶液：取卡泊三醇约4mg，精密称定，置10ml量瓶中，加2ml甲醇振摇使溶解，分别加入各杂质贮备液0.2ml，用稀释剂稀释至刻度，制成每1ml中约含卡泊三醇0.4mg、杂质k4μg、杂质l4μg和杂质m4μg的溶液作为系统适用性溶液；

27、(2)色谱条件设置：

28、色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶kromasil 100-5-c8，规格为4.6mm×250mm,5μm；

29、流动相：以水为流动相a，乙腈为流动相b进行梯度洗脱；

30、检测波长：264nm；

31、柱温：35℃；

32、流速：1.5ml/min；

33、进样量：20μl；

34、(3)检测和计算：

35、精密量取系统适用性溶液、对照溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；各杂质含量计算公式为：

36、杂质含量％＝a杂/a对×0.1％

37、式中：a杂为供试品溶液色谱图中各杂质峰面积；

38、a对为对照溶液色谱图中主峰面积。

39、根据本发明实施方案，所述稀释剂为乙腈和水的混合溶液，其中乙腈和水体积比为30～70﹕70～30；优选乙腈和水体积比为40：60。

40、根据本发明实施方案，所述的杂质的检测限度为供试品溶液色谱图中如有杂质峰，与杂质k峰、杂质l峰和杂质m峰保留时间一致的色谱峰，其峰面积均不得大于对照溶液的主峰面积的0.10％。

41、本发明的有益效果是：

42、(1)国内外现有的卡泊三醇质量标准(ep11、usp-nf2022、bp2023药典)中并没有提出相关检测杂质k、杂质l和杂质m的分离分析方法，且也没有任何相关的文献报道，因此本发明经过对高效液相色谱分析中的色谱柱、流动相体系、梯度比例等条件进行筛选，选用合适的流动相体系，保证稀释剂及其他杂质不干扰样品中杂质k、杂质l和杂质m的检测，保证卡泊三醇、杂质m、杂质k和杂质l色谱峰之间的分离度符合要求，最终建立了梯度洗脱的hplc分析方法，实现了对卡泊三醇中杂质k、杂质l和杂质m的检测与控制。

43、(2)本发明分析方法基线平稳，稳定性良好，专属性良好，可以准确检测卡泊三醇的有关物质，从而全面、准确、客观的评价产品质量，具有非常重要的意义。且本发明的检测方法对严格控制药品质量以及保证药品的安全性和有效性具有积极的作用。建立检测方法，分析杂质含量，对于卡泊三醇的质量研究具有重要意义。