狂犬病毒突变体在传统双光子大脑皮层深层神经元中的应用

本发明属于生物，具体涉及一种狂犬病毒突变体在传统双光子大脑皮层深层神经元中的应用；尤其在大脑皮层深层神经元胞体和亚细胞结构的高质量成像。

背景技术：

1、大脑是人体最重要的器官，神经科学家们一直致力于研究大脑。哺乳动物的皮层总共有6层，是大脑处理感觉信息的重要结构基础。要想探究大脑处理信息的机制,我们既要理解群体神经元是如何对外界刺激反应，也要理解单个神经元是如何整合来自树突上不同时间与空间的输入产生输出。

2、随着双光子技术的开发，在体研究突触整合方式确定了视皮层和听皮层第2/3以及4层神经元的树突在接收信息时的突触活动模式，也有研究在体感皮层第5层在行为模式下的树突整合方式。因为第6层位于皮层的最深层，目前的成像方法对第6层神经元的高分辨率成像都存在一定的局限。但皮层第6层是新皮层结构中最先发育的一层，不仅对大脑皮层神经网络的形成有着重要的作用，而且在增益调控、主动感知这些功能活动中也是有着不可替代的作用。因此，研究第6层神经元的信息处理机制，对我们了解大脑皮层信息处理机制有着很重要的作用。实现对第6层神经元的高质量功能成像是我们急需攻破的技术难题。

3、目前，主要有三种方法能实现体内深层脑组织的神经元的可视化观察：

4、1)用三光子激发取代双光子激发。对于相同的生物荧光团，较长波长的激发光可以使通过组织的散射减少；使用红移的荧光团(cal 590染料)提高成像深度也是同样的原理。

5、2)纠正激发光的波前，即使用自适应光学技术来纠正由脑组织引起的光学波前畸变，从而实现更深的成像。

6、3)通过手术方式移除表层的脑组织从而实现深层组织成像。

7、即目前研究皮层深层的成像方法都存在一定的局限。在体电生理盲插的方法难以判断记录到的细胞类型。应用双光子成像可以直接观察神经元，但双光子成像的非线性物理原理以及散射脑组织的不均匀性导致成像深度受限制(主要限制在500μm以内)。理论上，自适应光学系统和三光子成像系统允许更深的成像深度。但是，首先，这两种方法对激光功率要求高，或者需要额外建造复杂的仪器来实现；其次，这两种方法是从探测端进行优化，对于被检测的生物脑组织，激光功率不宜过高，否则会对神经元造成影响。但是目前标记神经元用于记录功能活动的方法主要是使用重组腺相关病毒，荧光表达弱，因此高质量的深层组织的功能成像还是受限于神经元的标记方法。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的主要目的在于：提供一种成本低、安全性高且能够在传统双光子显微镜下实现皮层深层神经元成像的狂犬病毒突变体及其应用。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、狂犬病毒突变体在传统双光子显微镜下实现大脑皮层深层神经元成像中的应用。

4、在某些优选实施例中，所述狂犬病毒突变体为cvs-n2c-δg-gcam6s。

5、在某些优选实施例中，所述大脑皮层深层神经元为大脑皮层l6中的ct神经元。

6、在某些优选实施例中，所述应用的对象为啮齿类、哺乳动物类等野生型、表达重组酶或四环素转录激活因子的转基因动物品系和/或非人灵长类动物。

7、一种大脑皮层l6中的ct神经元的钙成像病毒，所述钙成像病毒包括有效量的前述狂犬病毒突变体。

8、在某些优选实施例中，所述钙成像病毒还包括药学上可接受的载体。

9、与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

10、1)本发明中的狂犬病毒突变体，作为逆行标记病毒，cvs避免了由于染料加载/病毒注射到目标区域而对成像区域造成的潜在损害，这对成像质量的提高亦是一大益处；被标记神经元具有荧光表达高亮度的优势，对比重组腺相关(aav)病毒标记的神经元，cvs病毒标记的神经元荧光强度更强，成像信噪比明显提高；且其表达速度快，对比逆行染料(ctb)标记需要表达7天，逆行aav病毒标记需要表达21天，cvs病毒标记的细胞数以及细胞密度在3天的时候就达到了ctb表达7天或者aav表达21天的水平，大大地节约了时间成本；再者其具有标记细胞完整结构的能力，能完整地记录从树突棘到胞体的功能信号，这为研究单个神经元信息的输入-输出整合提供了一种合适的方法，特别是对深层的神经元。

11、2)将本发明中的狂犬病毒突变体用于大脑皮层深层神经元的成像，不需要像应用三光子激发或者自适应光学系统，需要额外建造复杂的仪器来实现深层神经元的成像。其在常规双光子显微镜下，就能实现对大脑皮层l6中的ct神经元高质量的功能成像，具有安全性高，使用成本低的技术特点。

技术特征：

1.狂犬病毒突变体在传统双光子显微镜下实现大脑皮层深层神经元成像中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述狂犬病毒突变体为cvs-n2c-δg-gcam6s。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述大脑皮层深层神经元为大脑皮层l6中的ct神经元。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用的对象为啮齿类、哺乳动物类等野生型、表达重组酶或四环素转录激活因子的转基因动物品系和/或非人灵长类动物。

5.大脑皮层l6中的ct神经元的钙成像病毒，其特征在于，所述钙成像病毒包括有效量的权利要求1-4中的狂犬病毒突变体。

6.根据权利要求5所述的钙成像病毒，其特征在于，所述钙成像病毒还包括药学上可接受的载体。

技术总结
本发明公开了一种狂犬病毒突变体在传统双光子显微镜下实现大脑皮层深层神经元成像中的应用，所述狂犬病毒突变体为CVS‑N2c‑ΔG‑GCaM6s。本发明还公开了包含有该狂犬病毒突变体的钙成像病毒；本申请中的狂犬病毒突变体，作为逆行标记病毒，用于被标记神经元具有荧光表达高亮度的优势，且其表达速度快，大大地节约了时间成本；再者其具有标记细胞完整结构的能力，能完整地记录从树突棘到胞体的功能信号，为研究单个神经元信息的输入‑输出整合提供了一种合适的方法，特别是对深层的神经元。其在常规双光子显微镜下，就能实现对深层神经元高质量的功能成像，具有安全性高，使用成本低的技术特点。

技术研发人员：古妙清,张健雄
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14