一种干血斑采样联合LC-MS/MS技术测定咖啡因及代谢产物的方法与流程

本发明属于药物检测领域，更具体地说，涉及一种干血斑采样联合液相色谱串联质谱技术测定早产儿体内咖啡因及其主要代谢产物的分析方法。

背景技术：

1、咖啡因(1，3，7-三甲基黄嘌呤)是早产儿呼吸暂停(aop)药物治疗的首选药物，与其他生物活性甲基黄嘌呤类药物(如茶碱和氨茶碱)相比，其治疗指数更宽，耐受性更好，半衰期更长。然而，咖啡因的最佳剂量方案仍然存在争议。标准剂量方案(负荷剂量为20mg/kg柠檬酸咖啡因，然后维持剂量为5–10mg/kg/d)被广泛使用，但在临床实践中发现咖啡因治疗反应的显著的个体间变异性。较高剂量的咖啡因似乎更有效，但仍可引起严重的不良反应，如心动过速，癫痫发作，肺水肿，代谢紊乱和小脑出血。因此，接受较高剂量咖啡因治疗的早产儿的治疗药物监测(therapeutic drug monitoring，tdm)已被2019的国家健康与护理卓越研究所指南推荐。此外，越来越多的证据表明，咖啡因的tdm对于接受较高剂量方案治疗，怀疑毒性或疗效不佳的早产儿是必要且具有成本效益的。

2、咖啡因在体内经cyp1a2和cyp2e1的催化可代谢为三种主要活性代谢物：可可碱(3,7-二甲基黄嘌呤)、副黄嘌呤(1,7-二甲基黄嘌呤)和茶碱(1,3-二甲基黄嘌呤)。由于超过90％的咖啡因被cyp1a2代谢，咖啡因已被普遍接受为cyp1a2代谢表型的特异性探针。对于早产儿而言，cyp1a2的代谢活性随着个体发育逐渐成熟，通过代谢物的含量变化可以反应出咖啡因在患儿发育过程中的动态代谢变化。因此，同时监测咖啡因及其三种主要代谢物对于调查早产儿cyp1a2的成熟和代谢表型以及优化咖啡因的剂量方案至关重要。

3、因其优异的内在选择性、灵敏度和稳健性，液相色谱法与串联质谱(liquidchromatography coupled with tandem mass spectrometry，lc-ms/ms)相结合被认为是tdm的金标准。以往已经开发了几种lc-ms/ms方法，用于同时测定人血浆或血清中的咖啡因及其主要代谢物。然而，这些方法都需要采样一定量的血液(范围从50到500μl)。由于循环血容量低，医源性贫血和输血风险增加，应避免对早产儿进行频繁或广泛的血液采样。尿液或唾液采样似乎是新生儿tdm的有希望的替代方案，但专门设计的采样装置和长采样时间限制了其临床应用。

4、作为常规静脉穿刺的另一个有吸引力的替代方案，干血斑(dried blood spot，dbs)因其侵入性最小，采样量低，易于运输和储存的优点而被广泛应用于新生儿筛查和新生儿tdm。先前的几项研究报道了通过dbs采样测定咖啡因和副黄嘌呤，但红细胞压积效应，这一临床生物分析领域接受dbs分析的关键障碍，对分析的影响仍未完全解决。到目前为止还没有报道通过dbs采样同时定量咖啡因，可可碱，副黄嘌呤和茶碱的方法。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明的目的首先是提供一种干血斑采样联合液相色谱串联质谱技术测定早产儿体内咖啡因及其主要代谢产物的分析方法；本发明方法具有较好的便捷性、灵敏性和稳定性，可应用于apo早产儿的临床tdm实践中。

2、本发明的另一目的是使用这种稳定准确的定量方法对aop患儿进行治疗药物监测。

3、本发明提供的技术方案如下：

4、一种干血斑采样联合lc-ms/ms技术测定咖啡因及代谢产物的方法，采用高效液相串联质谱技术检测经过前处理的干血斑样品中咖啡因及代谢产物，利用高效液相色谱将咖啡因及代谢产物与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以待测物的浓度为x轴，待测物与其内标峰面积的比值为y轴，建立标准曲线回归方程，以待测物与内标物峰面积比对标准曲线回归方程中待测物的理论浓度进行线性最小二乘法回归计算，以所得标准曲线回归方程计算干血斑样品中咖啡因及代谢产物的实测浓度；所述代谢产物包括副黄嘌呤、可可碱和茶碱；所述高效液相串联质谱技术的色谱条件为：采用75毫米长的c18色谱柱和5mm甲酸改性流动相梯度洗脱方法；采用含有125mm甲酸的80％甲醇溶液作为提取溶剂。

5、进一步的，使用10μl一次性定量毛细采血管用于制备干血斑样品，采用圆形金属打孔器将干燥后的干血斑样品冲切下来，折叠放入离心管中，在离心管中加入含125mm甲酸的80％甲醇溶液，将溶液涡旋后离心，取上清液放置于自动进样器中。

6、进一步的，涡旋混合和离心时间均为10分钟。

7、进一步的，内标工作溶液用100％甲醇稀释内标储备液配制而得；所述内标储备液为将咖啡因、咖啡因-氘9、副黄嘌呤、副黄嘌呤-氘3、可可碱、可可碱-氘6、茶碱和茶碱-氘6溶于100％甲醇中，最终制备得到5.00mg/ml的咖啡因储备液、1.00mg/ml的咖啡因-d9储备液、0.500mg/ml的副黄嘌呤储备液、0.500mg/ml的副黄嘌呤-氘3储备液、0.200mg/ml的可可碱储备液、0.250mg/ml的可可碱-氘6储备液、0.500mg/ml的茶碱储备液和1.00mg/ml的茶碱-氘6储备液。

8、进一步的，流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为含5mm甲酸的水溶液；流动相b为含5mm甲酸的甲醇溶液。

9、进一步的，梯度洗脱程序如下：

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11、进一步的，离子化模式采用电喷雾电离，正离子模式和多重反应监测。

12、进一步的，咖啡因的碰撞能量采用13v，副黄嘌呤的碰撞能量采用26v，可可碱的碰撞能量采用25v，茶碱的碰撞能量采用26v；咖啡因-d9的碰撞能量采用29v，副黄嘌呤-d3的碰撞能量采用28v，可可碱-d6的碰撞能量采用27v，茶碱的碰撞能量采用27v。

13、进一步的，分析/洗脱色谱柱为c18 75×4.6mm,i.d.,3.5μm,waters；柱温为35℃；自动进样器温度为4℃；进样体积为10.00μl。

14、进一步的，标准曲线参数如下所示：

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17、有益效果

18、本发明提供一种lc-ms/ms方法，通过dbs采样同时定量咖啡因及其三种主要代谢物。在方法开发和验证过程中，我们应用了几个关键技术来开发本方法。

19、(1)双定量采样技术准确采样

20、首先，目前已经认识到dbs采样提供了传统静脉穿刺的有吸引力的替代方案，因为它提供了微创技术以及血液收集，运输和储存方面的优势。然而，红细胞压积效应仍然是接受定量dbs分析的主要障碍。为了解决红细胞压积问题，使用10μl一次性定量毛细采血管收集固定体积的外周血并结合8mm全打孔干血斑提取技术，用于克服因dbs样品的红细胞压积水平变化而引入的偏倚。与其他复杂方法相比，这种方法由于其低成本和可获得性而易于在临床场景中实施。

21、(2)高回收率提取技术

22、其次，关于dbs样品的前处理，由于甲醇与流动相的相容性，首先选择甲醇作为萃取溶剂。然而，在这种条件下，分析物的提取回收率，特别是咖啡因的三种代谢物，还不够令人满意。因此，优化适当的提取程序以实现最大的和可重复的回收是另一个需要解决的挑战。如图3所示，向萃取溶剂中加入水以润湿和水合dbs样品导致更高的萃取回收率。添加补充的125mm甲酸可以进一步将提取回收率提高到近100％。在最后的优化过程中，用100μl含125mm甲酸的甲醇/水(80/20，v/v)混合物提取整个dbs样品。这种简单的手动提取方法可以转换为自动在线程序，这可能提供在大规模临床实践中实施的潜力，并结合dbs采样的优势。

23、(3)配对同位素内标消除基质效应技术

24、第三，虽然应用了配对稳定同位素标记的内标，但可可碱的基质效应不能完全消除。当应用可可碱-d6(m/z 187.0→168.8)的最佳mrm离子对时，发现了显著的离子抑制，这导致内标校正基质因子远远超过100％。令人惊讶的是，如果使用可可碱-d6的次优mrm离子对(m/z 187.0→143.9)，离子抑制将转换为与可可碱同步的离子增强，内标校正基质因子将减少到近100％，(如表9所示)。这种有趣的现象可以通过具有与可可碱的最佳mrm离子对(m/z 181.0→137.9)相同的电离特性和碎片离子(m/z 43.1)的可可碱-d6的次优(m/z187.0→168.8)而不是最优(m/z 187.0→168.8)mrm离子对来解释。

25、(4)碰撞能量缺损解决多组分浓度水平差异化一同分析技术

26、最后，在之前的研究中，我们发现早产儿咖啡因的浓度水平比三种主要代谢物高出两个数量级以上。要在单次分析运行中实现咖啡因及其三种初级代谢物的同时定量，需要克服过多离子同时到达质量检测器所导致的质量信号饱和。本文应用碰撞能量(ce)缺陷的实用策略对大浓度差引起的质量信号差异进行归一化。具体的方法是将咖啡因的最佳ce减半(从26v到13v)。如图4所示，当使用减半的ce时，咖啡因的峰值强度在105至106cps内，这与其三种代谢物的峰值强度处于相同的数量级。此外，应该指出的是，在非早产儿人群中进行相关的研究如成人cyp1a2的代谢表型研究时，由于咖啡因及其代谢物的浓度范围在相同的数量级，因此应当采用咖啡因的最佳ce(26v)。

27、综上，本研究首次开发并充分验证了一个灵敏、可靠、方便和稳健的lc-ms/ms方法，通过10μl定量毛细管采样结合全打孔dbs样品制备技术同时定量咖啡因及其三种主要代谢物。采用四个配对稳定同位素标记的内标和碰撞能量缺陷策略进行准确定量。四种分析物的准确和精确定量不受dbs样品红细胞压积水平的影响。在dbs和血浆药物浓度之间观察到令人满意的平行性，一致性和相关性，表明该方法的临床适用性良好，可应用于相关的药代动力学和tdm研究。更重要的是，所提出的方法已成功地应用于咖啡因及其三种主要代谢物的临床tdm实践，为促进和支持早产儿咖啡因的精确给药提供了有价值的信息。