改性CFME、多巴胺传感器以及体外检测多巴胺的方法

本发明属于多巴胺传感器，具体涉及一种改性cfme、多巴胺传感器以及体外检测多巴胺的方法。

背景技术：

1、神经递质是维持大脑活动和功能稳态的重要分子，其在大脑中的相对和基础水平与特定疾病状态直接相关。多巴胺(da)是一种内源性含氮有机物质，是酪氨酸代谢为二羟基苯丙氨酸的中间产物。作为中枢神经系统(cns)和外周神经递质中的主要神经递质之一，它在人类中枢神经系统中发挥着重要作用，调节各种生理功能，包括运动、认知、记忆、学习和奖励。da水平异常与成瘾、药物滥用、帕金森病、精神分裂症等神经系统疾病的发生密切相关。因此，在体内原位获得多巴胺的化学信息对于了解da在大脑功能中的分子机制至关重要。

2、基于微电极的电化学平台，特别是碳纤维微电极(cfme)，具有优异的时空分辨率。其直径只有几微米，对大脑神经组织的损伤较小，已成为体内神经化学物质检测的主要方法。尽管有许多电化学传感器已被报道用于da检测，但有两个主要挑战阻碍了da电化学传感器在体内的应用。一方面，da的氧化还原过程受到大脑中共存的电活性物质的严重干扰，如抗坏血酸(aa)和尿酸(ua)，它们在裸电极上具有高度相似的氧化电位。另一方面，da的含量低至纳摩尔水平，比实际大脑中电活性干扰物的含量低2-4个数量级。

3、为了解决这些问题，本领域技术人员开发了快速扫描循环伏安法(fscv)、电极化学修饰和电化学微晶体管器件，以提高da活体检测的选择性和灵敏度。如wightman等人开创的fscv被用于高时间分辨率的da检测。然而，这种方法需要底物氧化来收集信号，因此无法有效地将da与其他结构相似的神经递质区分开来。此外，本领域技术人员还开发了一种快速扫描电位门控有机电化学晶体管(oect)，用于灵敏地检测da。遗憾的是，oect材料目前仍存在一系列问题，限制了其广泛应用。相比之下，在电极表面使用聚合物或分子识别配体的化学修饰策略似乎更有潜力。然而，如何在确保高灵敏度和选择性的基础上修饰电极以满足体内da检测所需的防污性、生物相容性和长期稳定性，仍然是一项具有挑战性的工作。

4、生物质衍生碳点(bdcds)得益于其大表面积、光学性质、优异的导电性和高化学稳定性，目前越来越受到人们的关注，并已应用于生物成像、传感器、药物载体等领域。与其他电极修饰材料相比，bdcd表现出优异的导电性、高生物相容性和亲水性。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于检测脑和细胞中多巴胺的改性cfme(ewcds@nafion/auncs/cfme)，本发明用带负电的生物相容性材料修饰微电极，制得的改性微电极具有高灵敏度、高选择性和生物相容性，为细胞以及活体大脑中多巴胺的实时原位检测提供了技术支持。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、用于检测脑和细胞中多巴胺的改性cfme，所述改性cfme的制备方法为：通过溅射在预处理后的碳纤维表面修饰金纳粒子，获得aunps/cf；利用电沉积法在所述aunps/cf电极表面生长金纳米珊瑚，获得auncs/cf；然后利用基于蛋清的ewcds修饰所述auncs/cf，制得所述改性cfme。

4、本专利提出了一种新的体内da传感策略，通过合理设计和优化，用带负电的生物相容性材料修饰微电极。首先，基于蛋清的生物质衍生碳点用于电极表面修饰，为da的电化学催化提供了丰富的活性位点。同时，带负电荷的特性使ewcds成为抵抗负电性神经化学物质(aa，ua)的良好材料，从而提高了选择性。此外，安全和可追溯的食物来源赋予ewcds优异的生物相容性，大大提高了体内da检测的可靠性。

5、进一步，所述预处理为：先将cf依次在丙酮、hno3、koh和蒸馏水中进行超声处理；然后对cf进行电化学活化。

6、进一步，所述hno3的浓度为3m，所述koh的浓度为1m；所述超声的时间均为5分钟。

7、进一步，所述电化学活化包括以下步骤：首先在0.5m h2so4中以+1.5v电位进行80s的电位控制安培法，以及通过在-1.0v至1.0v的电位范围内以50mv·s-1的扫描速率进行循环伏安法，直到获得稳定的循环伏安图。

8、进一步，所述溅射的时间为70s。

9、进一步，所述ewcds采用nafion进行固定，所述ewcds的浓度为0.01g/l。

10、进一步，所述ewcds的制备方法为：将200ml蛋清在750w下微波加热25分钟，蛋清从浅黄色透明液体变为黄棕色固体；使用研钵研磨黄棕色固体以获得粉末，将其添加到100ml超纯水中并充分搅拌一晚，获得混合物；将混合物以12000转/分离心20分钟以去除大尺寸颗粒。使用0.22μm膜对上清液进行真空过滤，并用透析袋(mwco＝1.0kd)在超纯水中进一步透析72小时，每4小时更换一次透析液，获得ewcds的悬浮液；通过冷冻干燥获得ewcds粉末。

11、更进一步，ewcds/nafion复合溶液的制备方法为：将5ml ewcds(0.01mg/ml)分散在20ml nafion溶液(0.5wt.％)中，制得ewcds/nafion复合溶液。然后，对混合溶液进行超声处理以产生均匀分散的溶液。

12、ewcds@nafion/auncs/cfme的制备：将auncs/cfs电极浸入ewcds/nafion复合膜溶液中五次，每次浸入之间延迟5分钟进行干燥，制得所述改性cfme。

13、进一步，所述电沉积法为：以所述aunps/cf为工作电极，ag/agcl为参比电极，pt丝为对电极，在混合溶液中进行电化学沉积；电沉积时间为12h。

14、更进一步，控制电压为-0.7v。

15、进一步，所述混合溶液为aucl3、ctab、nano3和超纯水的混合溶液，所述aucl3的浓度为5mm，ctab的浓度为9mm，nano3的浓度为20mm。

16、进一步，所述改性cfme的xrd图谱在2θ值为38.27、44.44、64.70和77.702有衍射峰，分别对应金的111、200、220和311晶面；所述改性cfme的o1s光谱有2个位于535.5ev和532.1ev处的特征峰，分别对应nafion和ewcds中的o元素；所述改性cfme的c1s光谱有3个位于287.4ev、289.2ev和291.8ev处的特征峰，对应于c元素；au 4f光谱有2个位于88.1ev和84.4ev的特征峰，分别对应au 4f5/2和au 4f7/2的原子轨道。

17、本发明的目的之二在于提供一种含有所述改性cfme的多巴胺传感器。

18、该多巴胺传感器基于cfme和金纳米结构，并采用基于蛋清的生物质衍生碳点进行电极表面修饰。基于ewcds的负电性和生物相容性，本发明提供了一种优化的可脑植入的多巴胺传感器，通过病理生理模型的验证，该传感器实现了可靠地跟踪活体大脑中da的复杂动态变化。

19、作为优选，所述多巴胺传感器为三电极体系，所述改性cfme作为工作电极，铂丝作为对电极，ag/agcl电极作为参比电极。

20、选择性和灵敏度是多巴胺传感器在体内应用的两大障碍，如何在确保高灵敏度和选择性的基础上设计和构建电极，以满足复杂生物流体中da检测所需的防污性、稳定性和生物相容性，仍然是一个巨大的挑战。而本发明通过在电极上修饰ewcds来提高多巴胺传感器的选择性，同时在活体大脑中灵敏地测定da。在此基础上开发的改性cfme(ewcds@nafion/auncs/cfme)对da的实时跟踪表现出高选择性，并且成功地应用于细胞和大鼠大脑中da的实时监测。结果表明，ewcds@nafion/auncs/cfme可作为一种新的可靠性体内da跟踪平台，有助于了解da在神经系统中参与的生理和病理功能。

21、本发明的目的之三在于提供一种利用所述多巴胺传感器体外检测多巴胺的方法，该多巴胺传感器在0.001μm-20μm范围内具有良好的线性关系，检测限为0.765nm。

22、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

23、利用所述多巴胺传感器体外检测多巴胺的方法，包括以下步骤：

24、(1)制备待测样本；

25、(2)利用权利要求2所述的多巴胺传感器对待测样本进行电化学检测，获得电流响应；

26、(3)根据所述电流响应对待测样本中的多巴胺进行定性和/或定量分析。

27、进一步，所述待测样本为离体活细胞和/或脑片。

28、进一步，检测电位为0.25v。

29、进一步，将测得的电流响应代入标准曲线方程计算得到多巴胺的含量；所述多巴胺的浓度在0.001μm-20μm时，所述标准曲线方程为：y＝0.489x-9.741，r2＝0.996，其中，y为y轴，代表电流信号，单位为na；x为x轴，代表多巴胺浓度，单位为μm。

30、本发明的有益效果在于：

31、(1)本发明通过nafion固定ewcds，开发了一种da选择性传感策略。ewcds的加入不仅提高了生物相容性，还改变了电极的表面电荷，提高了其对da的选择性。本发明开发的改性cfme(ewcds@nafion/auncs/cfme)能够实现da的原位实时检测并准确跟踪复杂大脑中低至纳摩尔水平的da浓度变化。

32、(2)本发明利用制得的多巴胺传感器对pc12细胞群和脑片中的da进行了检测，发现，多巴胺在pc12细胞群和脑片中的释放过程不同。脑片中的da基础释放水平较高，同时伴有da的重吸收。本发明证实了携带电荷的生物衍生材料在神经递质传感中的潜力，本发明所提供的da选择性传感策略有望推动一种新的、简单的大脑神经化学物质体内测量平台的进一步发展。

33、(3)本发明的多巴胺传感器不受抗坏血酸和尿酸等大脑中共存的电活性物质的干扰，可以实现含量低至纳摩尔水平的多巴胺的有效检测。