测定食品中琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂残留量的方法与流程

本发明涉及农产品残留物的检测领域，特别是涉及测定食品中琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂残留量的方法。

背景技术：

1、琥珀酸脱氢酶抑制剂(succinate dehydrogenase inhibitors,sdhis)是一类通过抑制病原菌琥珀酸脱氢酶活性从而干扰其呼吸作用的新型杀菌剂。sdhis主要包括苯并烯氟菌唑、异丙噻菌胺、氟唑菌酰羟胺、麦锈灵、氟唑菌酰胺、氟酰胺、灭锈胺、甲呋酰胺、萎锈灵、氧化萎锈灵、啶酰菌胺、噻呋酰胺、呋吡菌胺、吡噻菌胺等，目前该类杀菌剂主要应用于蔬菜、水果、粮食等经济作物的杀菌和防霉。

2、虽然sdhis类杀菌剂毒性较低，但因其使用日益广泛，sdhis杀菌剂残留对农产品质量安全造成严重影响。为了保障人类饮食安全，美国、日本、韩国、国际食品法典委员会(cac)和欧盟等均制定了多种sdhis相关最大残留限量(mrls)。

3、一方面是sdhis类杀菌剂快速增大的市场占有率及不断拓展的农产品使用范围，另一方面的现实困境却是我国虽然已经限定多种sdhis在多种产品基质中的最大残留量(mrls)，但并无配套的检测方法。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明提供一种测定食品中琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂残留量的方法，该方法能够对高含水量食品、高含油量食品、高蛋白食品等复杂多样的食品中琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂的残留量进行检测，适用于食品的品质监控。

2、本发明提供了一种测定食品中琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂残留量的方法，该方法包括以下步骤：

3、前处理：通过液液萃取法和盐析法对待测样品进行提取，得到提取液，通过分散固相萃取法对所述提取液进行净化，过滤，得到待检测溶液；

4、检测：将待检测溶液通过超高效液相色谱-质谱/质谱法进行检测，得到待测样品中琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂残留量。

5、本发明人在研究中发现，常用于食品中农产品残留量的检测方法主要有免疫分析法、气相色谱(gc)法、气相色谱-质谱(gc/ms)法、液相色谱(lc)法和液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)法。其中，lc-ms/ms分离能力强，可同时定性定量测定多种组分，但前期研究中待测样品主要为植物源性食品，尤其是蔬菜和水果，定量限跨度为0.01-0.3mg/kg，检测范围所覆盖的sdhis类杀菌剂和基质种类均有限，各标准检测的目标药物、基质、测定低限各不相同，无法满足gb 2763-2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》，难以适应主要进口国家或地区对动物源食品越来越高的安全卫生标准和越来越严的要求。并且，因待检测的食品复杂多样，有些食品油脂高，有些食品糖分高，有些食品色素深，因此如何有效地去除多种食品中复杂的杂质，减少对仪器的损伤，是本发明构建食品中琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂残留量的测定方法的关键难点。因此，本发明人提出上述方法，先结合待测样品的特性通过液液萃取法和盐析法进行提取，然后通过超高效液相色谱-质谱/质谱法进行检测，从而使该方法能够对高含水量食品、高含油量食品、高蛋白食品等复杂多样的食品中琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂的残留量进行检测，适用于食品的品质监控。

6、在其中一个实施例中，所述提取包括以下步骤：通过液液萃取法对待测样品进行萃取，加入除水剂，振荡，离心；

7、所述净化包括以下步骤：将所述提取液与除水剂、固相吸附剂混合，涡旋，离心。

8、在其中一个实施例中，所述液液萃取法的萃取剂包括以下原料中的至少1种：乙腈，甲酸，或正己烷；

9、所述除水剂包括柠檬酸二钠盐倍半水合物，柠檬酸钠，氯化钠，或硫酸镁中的至少1种。本发明的方法中，针对部分待测样品，结合其特性，通过液液萃取法进行萃取后，加入除水剂，除水剂中的柠檬酸二钠盐倍半水合物、柠檬酸钠使目标化合物能够保持稳定。

10、在其中一个实施例中，所述食品为蔬菜，水果，食用菌，奶，谷物，油料，坚果，水果干，茶叶，调味料，动物组织，蛋或植物油；

11、所述分散固相萃取法的固相吸附剂包括以下原料中的至少1种：n-丙基乙二胺，石墨化碳黑，或十八烷基硅烷。

12、本发明的方法能够适用于上述食品中琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂残留量的检测，该食品所囊括的范围不止于高含水量的蔬菜水果，还包括高含油量的坚果、脂肪、食用油、动物组织，低水分、高蛋白的谷物、乳、蛋，以及归属于特殊样品的调味料、水果干、茶叶。

13、在其中一个实施例中，当所述待测样品为蔬菜、水果、食用菌或奶，所述提取包括以下步骤：按照每克待测样品加入1±0.1ml萃取剂的量进行萃取，萃取后，按照每克待测样品加入0.65±0.05g除水剂的量进行盐析，振荡，离心；所述萃取剂包括乙腈，所述除水剂包括柠檬酸二钠盐倍半水合物、柠檬酸钠、氯化钠和硫酸镁，所述柠檬酸二钠盐倍半水合物、所述柠檬酸钠、所述氯化钠与所述硫酸镁的重量份比为0.5∶1∶1∶4；

14、当所述待测样品为谷物、油料、坚果或水果干，所述提取包括以下步骤：按照每克待测样品加入2±0.2ml萃取剂的量进行萃取，萃取后，按照每克待测样品加入1.3±0.1g除水剂的量进行盐析，振荡，离心；所述萃取剂包括正己烷饱和的乙腈溶液；所述除水剂包括柠檬酸二钠盐倍半水合物、柠檬酸钠、氯化钠、硫酸镁，所述柠檬酸二钠盐倍半水合物、所述柠檬酸钠、所述氯化钠与所述硫酸镁的重量份比为0.5∶1∶1∶4；

15、当所述待测样品为茶叶或调味料，所述提取包括以下步骤：按照每克待测样品加入4±0.4ml萃取剂的量进行萃取，萃取后，按照每克待测样品加入2.6±0.2g除水剂的量进行盐析，振荡，离心；所述萃取剂包括正己烷饱和的乙腈溶液；所述除水剂包括柠檬酸二钠盐倍半水合物、柠檬酸钠、氯化钠、硫酸镁，所述柠檬酸二钠盐倍半水合物、所述柠檬酸钠、所述氯化钠与所述硫酸镁的重量份比为0.5∶1∶1∶4；

16、当所述待测样品为动物组织或蛋，所述提取包括以下步骤：按照每克待测样品加入2±0.2ml萃取剂的量进行萃取，萃取后，按照每克待测样品加入1.3±0.1g除水剂的量进行盐析，振荡，离心；所述萃取剂包括正己烷饱和的乙腈溶液；所述除水剂包括柠檬酸二钠盐倍半水合物、柠檬酸钠、氯化钠和硫酸镁，所述柠檬酸二钠盐倍半水合物、所述柠檬酸钠、所述氯化钠与所述硫酸镁的重量份比为0.5∶1∶1∶4；

17、或当所述待测样品为植物油，所述提取包括以下步骤：按照每克待测样品加入2±0.2ml萃取剂的量进行萃取，萃取后，按照每克待测样品加入0.4±0.04g除水剂的量进行盐析，振荡，离心；所述萃取剂包括乙腈；所述除水剂包括氯化钠。

18、在其中一个实施例中，当所述待测样品为蔬菜、水果、食用菌、谷物、油料或坚果，所述净化包括以下步骤：按照每毫升提取液加入150±15mg除水剂，按照每毫升提取液加入70±7mg固相吸附剂，涡旋，离心；所述除水剂包括硫酸镁，所述固相吸附剂包括n-丙基乙二胺和石墨化碳黑，所述n-丙基乙二胺与所述石墨化碳的重量份比为5∶2；

19、当所述待测样品为奶、动物组织、蛋或植物油，所述净化包括以下步骤：按照每毫升提取液加入150±15mg除水剂，按照每毫升提取液加入100±10mg固相吸附剂，涡旋，离心；所述除水剂包括硫酸镁，所述固相吸附剂包括n-丙基乙二胺和十八烷基硅烷，所述n-丙基乙二胺与所述十八烷基硅烷的重量份比为1∶1；

20、或当所述待测样品为茶叶、水果干或调味料，所述净化包括以下步骤：按照每毫升提取液加入150±15mg除水剂，按照每毫升提取液加入120±12mg固相吸附剂，涡旋，离心；所述除水剂包括硫酸镁，所述固相吸附剂包括n-丙基乙二胺、十八烷基硅烷和石墨化碳黑，所述n-丙基乙二胺、所述十八烷基硅烷与所述石墨化碳黑的重量份比为5∶5∶2。

21、上述净化步骤中针对不同的食品的待测样品采用不同的固相吸附剂组合，使检测方法具有特异性和针对性，检测结果更精准。

22、在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱-质谱/质谱法的液相条件包括：

23、固定相：碳十八烷基硅烷基键合硅胶为填料的色谱柱；

24、流动相：以甲醇为流动相a，以含有甲酸铵和甲酸的水溶液为流动相b，采用梯度洗脱方式。

25、流动相中加入适量的甲酸铵可以使待测物在测试时成为离子状态，然后在电喷雾过程中将离子从溶液中转移至气相，使气相离子的生成过程更容易完成，从而提高待测物的离子化效率，同时还可以抑制待测物与色谱柱固定相中残留硅羟基之间的“二次作用”，达到改善峰形，提高分离效果的作用。

26、在其中一个实施例中，所述流动相b中甲酸铵的浓度为5±0.5mmol/l，甲酸的体积百分数为0.1±0.01％；所述色谱柱为aq-c18色谱柱，规格为2.1×150mm，填料粒径为2.6μm；

27、所述梯度洗脱条件为：

28、0-4min，流动相b的体积百分数由80％变化至10％；

29、4-7min，流动相b的体积百分数为10％；

30、7-7.5min，流动相b的体积百分数由10％变化至80％；

31、7.5-10min，流动相b的体积百分数为80％。

32、采用上述aq-c18色谱柱与常规液相色谱柱相比，具有更高的灵敏度和更高的分离能力，且分离时间较常规液相色谱柱大大缩短。

33、在其中一个实施例中，所述液相条件还包括：

34、柱温：40±5℃；

35、平衡时间：1±0.1min；

36、进样量：2±0.2μl；

37、流速：0.3±0.03ml/min。

38、在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱-质谱/质谱法的质谱条件包括：

39、离子源：电喷雾离子源；

40、扫描方式：正离子扫描；

41、检测方式：多反应检测方式；

42、鞘气：4.09±0.4l/min；

43、辅助气：7.97±0.8l/min；

44、吹扫气：1.5±0.2l/min；

45、离子源温度：300±30℃；

46、传输管温度：350±35℃；

47、电喷雾电压：3000±300v。

48、在其中一个实施例中，所述待测样品的待测浓度为0μg/l-100.0μg/l。

49、在其中一个实施例中，所述食品包括菠菜，葡萄，鲜冬菇，大米，大豆，核桃，茶叶，葡萄干，干辣椒，牛奶，鸡蛋，猪肉，或花生油中的至少一种。

50、在其中一个实施例中，所述琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂包括麦锈灵，苯并烯氟菌唑，联苯吡菌胺，啶酰菌胺，萎锈灵，甲呋酰胺，氟醚菌酰胺，氟吡菌酰胺，氟酰胺，氟唑菌酰胺，呋吡菌胺，异丙噻菌胺，吡唑萘菌胺，灭锈胺，氧化萎锈灵，氟唑菌苯胺，吡噻菌胺，(1-甲基-3-三氟甲基-1h-吡唑-4-基)甲酰胺，氟唑菌酰羟胺，氟唑环菌胺，或噻呋酰胺中的至少一种。

51、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

52、本发明的一种测定食品中琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂残留量的方法，该方法能够对高含水量食品、高含油量食品、高蛋白食品等复杂多样的食品中琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂的残留量进行检测，适用于食品的品质监控。