试剂盒及其制备工艺的制作方法

本发明涉及体外诊断，特别涉及试剂盒及其制备工艺。

背景技术：

1、柯萨奇病毒a16型(coxsackievirus a16，ca16)属于小核糖核酸病毒目、小核糖核酸病毒科、肠道病毒种。病毒基因组为长度8.5kb的正链rna，基因组rna的5’端共价偶联vpg蛋白驱动病毒基因组的转录。病毒形态为裸露20面体病毒(t＝3)，病毒颗粒直径为30nm左右。

2、手足口病是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，其中以柯萨奇病毒a16型(cox a16)和肠道病毒71型(ev 71)最为常见。

3、手足口病多发生于5岁以下儿童，表现口痛、厌食、低热、手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，多数患儿一周左右自愈，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿病情发展快，导致死亡。目前缺乏有效治疗药物，主要对症治疗。

4、柯萨奇病毒a16型是引起hfmd主要病原体之一。近几年，非肠道病毒71型(enteroviruses 71，ev71)及肠道病毒感染引起重症感染有逐渐上升趋势，其中主要包括ca16。因此，开发试剂盒区分ev71型和ca16型病毒感染引起的手足口病在诊疗上具有显著的意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了试剂盒及其制备工艺，其灵敏度、特异性和精密度优异，且可区分手足口病中的ev71和柯萨奇a16两种病原体，测试间重复性高，标准易于控制。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了组合物，包括肠道病毒71型重组抗原和酶标记的柯萨奇病毒a16型重组抗原；

4、所述肠道病毒71型重组抗原包括肠道病毒71型多聚蛋白p1和/或肠道病毒71型3cd蛋白酶；和/或

5、所述柯萨奇病毒a16型重组抗原包括柯萨奇病毒a16型多聚蛋白p1和/或柯萨奇病毒a16型3cd蛋白酶；

6、其中：编码所述肠道病毒71型多聚蛋白p1的核酸分子具有：

7、(1)、如seq id no.5所示的核苷酸序列；或

8、(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或

9、(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

10、和/或

11、编码所述肠道病毒71型3cd蛋白酶的核酸分子具有：

12、(4)、如seq id no.6所示的核苷酸序列；或

13、(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或

14、(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

15、和/或

16、编码所述柯萨奇病毒a16型多聚蛋白p1的核酸分子具有：

17、(7)、如seq id no.2所示的核苷酸序列；或

18、(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(7)的相同或相似；或

19、(9)、与如(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

20、和/或

21、编码所述柯萨奇病毒a16型3cd蛋白酶的核酸分子具有：

22、(10)、如seq id no.3所示的核苷酸序列；或

23、(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(10)的相同或相似；或

24、(12)、与如(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

25、所述多个为2个至500个。

26、在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物中：

27、所述柯萨奇病毒a16型包括柯萨奇病毒a16型r37/yn/chn/2013株、柯萨奇病毒a16型tainan株、柯萨奇病毒a16型g10株、柯萨奇病毒a16型bj09/06株或柯萨奇病毒a16型107/toyama/1990株中的一种或多种；和/或

28、所述肠道病毒ev71包括肠道病毒71型brcr株、肠道病毒71型fuyang.anhui.p.r.c/17.08/3株、肠道病毒71型7423/ms/87株、肠道病毒71型sth/mcn/2006株或肠道病毒71型bj08-z025-5株中的一种或多种。

29、在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物包括：

30、所述酶标记的柯萨奇病毒a16型重组抗原的制备方法包括：将柯萨奇病毒a16型重组抗原与过碘酸钠活化的辣根过氧化物酶以摩尔比1:5混合，孵育，再与含有甘油终浓度为50％的pbs缓冲液混合，获得所述辣根过氧化物酶标记的柯萨奇病毒a16型重组抗原；

31、和/或

32、所述柯萨奇病毒a16型重组抗原或所述肠道病毒71型重组抗原的制备方法包括：将编码所述柯萨奇病毒a16型重组抗原的基因或编码所述肠道病毒71型重组抗原的基因插入昆虫杆状病毒表达载体，获得重组载体，表达所述重组载体，获得所述柯萨奇病毒a16型重组抗原或所述肠道病毒71型重组抗原。

33、在本发明的一些具体实施例方案中，上述试剂盒中所述柯萨奇病毒a16型重组抗原或肠道病毒71型重组抗原的所述表达载体的制备方法包括：将柯萨奇病毒a16型或肠道病毒71型的多聚蛋白p1构建到pfbdcmv的ph启动子后方，由ph启动子控制表达；将对应的3cd蛋白酶基因构建到cmv启动子后方，由cmv启动子控制表达，获得所述表达载体。

34、在本发明的一些具体实施例方案中，上述试剂盒中所述柯萨奇病毒a16型重组抗原或所述肠道病毒71型重组抗原的制备方法包括：采用sf9细胞制备p3代昆虫杆状病毒液，感染sf9细胞，感染复数moi为1；病毒感染64小时后，收集细胞培养上清，采用下述切向流过滤、peg6000沉淀、阴离子交换层析、复合模式层析、密度梯度离心方法中的若干种方法联用纯化，获得所述柯萨奇病毒a16型重组抗原或所述肠道病毒71型重组抗原。

35、在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物的所述昆虫杆状病毒表达载体具有：

36、(13)、如seq id no.1所示的核苷酸序列；或

37、(14)、如(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(13)的相同或相似；或

38、(15)、与如(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

39、所述多个为2个至500个。

40、本发明还提供了上述组合物在排除柯萨奇病毒a16型检测中肠道病毒71型假阳性中的应用。

41、本发明还提供了上述组合物在制备检测抗柯萨奇病毒a16型igm的试剂或试剂盒中的应用。

42、本发明还提供了上述组合物在如下方面中的应用：

43、(a)、制备柯萨奇病毒a16型感染的诊断试剂或诊断试剂盒；和/或

44、(b)、制备手足口病诊断试剂或诊断试剂盒。

45、本发明还提供了上述试剂，包括上述组合物，以及可接受的辅料或助剂。

46、本发明还提供了上述试剂盒，包括上述试剂，以及可接受的辅料或助剂。

47、在本发明的一些具体实施方案中，上述试剂盒还包括包被鼠抗人igm单克隆抗体的磁性颗粒、磁性颗粒封保液、样本稀释液、酶结合物稀释液、洗涤液、底物a液、底物b液、阴性对照或阳性对照中的一种或多种。

48、在本发明的一些具体实施方案中，上述试剂盒包括：

49、所述包被鼠抗人igm单克隆抗体的磁性颗粒的制备方法包括：将0.2μg/人份的默克厂家磁微粒和0.5μg/人份的鼠抗人igm单克隆抗体混合，孵育2小时，与casein终浓度为1％的pbs缓冲液混合，获得所述包被鼠抗人igm单克隆抗体的磁性颗粒；和/或

50、所述阳性对照包括嵌合人igm fc片段的鼠抗柯萨奇病毒a16型抗体和含有20％小牛血清pbs缓冲液；和/或

51、所述阴性对照包括含有20％小牛血清的pbs缓冲液；和/或

52、所述样本稀释液包括含有2％ bsa的0.05m tris-hcl且ph为7.4的缓冲液；和/或

53、所述洗涤液包括含0.1％ tween20的pbs磷酸盐缓冲液；和/或

54、所述酶结合物稀释液包括含有20％小牛血清的0.05m tris-hcl且ph为7.4的缓冲液；和/或

55、所述底物a液和所述底物b液包括含有鲁米诺的缓冲液。

56、本发明的试剂盒有如下效果：

57、1、通过ev71封闭抗原的使用，实现了区分ev71与ca16感染引起的手足口病，避免了ev71感染引起的交叉；

58、2、通过制备病毒样颗粒重组抗原，规避了使用天然病毒来源材料所引起的潜在感染风险；

59、3、通过辣根过氧化物酶标记的重组抗原，组装成柯萨奇病毒a16型igm抗体捕获法试剂盒，可以对柯萨奇病毒a16型igm阳性血清进行特异性识别。