一种定量检测表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的方法

本发明涉及一种分析检测方法，具体地说是种以四氮杂十四环二烯镍配合物[nil](clo4)2催化的非线性振荡体系对表没食子儿茶素没食子酸酯（egcg）的检测方法，属于分析化学领域。

背景技术：

1、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，egcg），其结构式如（ⅰ）所示是茶多酚中最有效的活性成分，属于儿茶素。儿茶素类化合物是茶叶中的主要功能成分，占茶叶干质量的12%～24%。为众所知，儿茶素具有抗炎症、抗菌、抗病毒及抗氧化等效用，可通过清除活性氧簇（ros）、no或与ros反应生成稳定化合物的方式有效平衡人体内自由基。随着对儿茶素研究愈加深入，更多药理功能被发现，儿茶素可通过调节相关酶活性或与相关酶蛋白特异性结合抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡，但不同儿茶素单体间存在明显差异；儿茶素还可预防心脑血管疾病以及保护肾脏、肝脏和神经系统等，在食品工业上可作抗氧、抑菌、保鲜、祛臭剂；在日化产品上作特殊功能的保质剂、护肤剂。

2、目前，国内有很多种检测egcg的方法，超高效液相色谱法，反相高效 液相色谱法，高效液相色谱（hplc）等仪器分析检测egcg。这些方法具有操作复杂、成本较高的缺点，本发明所涉及的egcg的定量分析方法具有准确度高、易于操作和方便快捷等特点。

3、结构式（ⅰ)表没食子儿茶素没食子酸酯（egcg）

技术实现思路

1、本发明旨在为egcg提供一种新的检测方法，即以四氮杂十四环二烯镍配合物[nil](clo4)2催化的非线性振荡体系对egcg的检测方法，本方法是基于该配合物催化的非线性体系（即振荡体系）对egcg的敏锐响应而开发的一种电化学振荡体系法。具体地说，就是加入不同浓度的egcg样本溶液到振荡体系中，产生抑制时间不同，建立起被测物浓度与抑制时间之间关联的工作曲线(如线性关系图)，从而实现对egcg的定量分析。 本发明所称四氨杂十四环二烯镍配合物是5, 7, 7, 12, 14, 14-六甲基-1, 4, 8, 11-四氮杂环十四-4, 11-二烯为配体的四氨杂大环镍配合物，其化学式为[nil](clo4)2，其结构如式(ii)所示。

2、

3、结构式(ii)[nil](clo4)2

4、本配合物的结构属于多羟基黄酮类化合物，这种以[nil](clo4)2催化的化学振荡反应和植物和动物细胞体内的生化振荡类似，因此，该体系具有稳定的振幅，较长的振荡寿命，及对egcg的敏锐响应等特点。

5、[nil](clo4)2按参考文献合成: 1)制备l·2hclo4；2) 由l·2hclo4制备[nil](clo4)2。

6、(1)制备l·2hclo4:

7、参考文献:

8、1.curtis, n. f. and hay, r. w.,j. chem. soc.，chem. commun.，1966,p.534.

9、2.gang hu, panpan chen, wei wang, lin hu, jimei song, lingguang qiu,juan song, electrochimica acta, 2007, vol. 52, pp.7996-8002.

10、3.lin hu, gang hu, han-hong xu, j. anal. chem.，20060 vol. 61, no.10,pp.1021-1025.

11、4.胡刚，中国科学技术大学博士论文，p25-27，合肥，2005 年。

12、(2)由l·2hcio4制备[nil](clo4)2:

13、参考文献:

14、1. n. f. curtis, j. chem. soc. dolton tran., 1972, vol.13, 1357.

15、2.胡刚，中国科学技术大学博士论文，p42-43,合肥，2005年。

16、经元素分析及红外表征确认为该配合物。

17、本检测方法与现有技术的区别是应用“h2so4- kio3- [nil](clo4)2- ma (丙二酸)-h2o2”briggs-rauscher非线性振荡体系作为检测溶液，利用不同浓度的egcg对振荡图谱的特征响应（抑制时间）不同，建立起被测物浓度与抑制时间之间关联的工作曲线，进而实现对egcg的定量分析。检测溶液中各组分的浓度如表1所示:

18、表1 briggs-rauscher振荡反应溶液中各组分的浓度范围

19、具体操作如下:

20、1、按表1配制检测溶液，并记录该溶液电位(potential)随时间(time)变化的曲线即化学电位振荡图谱。

21、配制好的检测溶液加入50 ml小烧杯中并放入大小合适的磁子，放在恒温磁力加热搅拌器上，保持搅拌速度在800转/分钟，在冰浴条件下使烧杯里的温度维持在-4~2°c。然后，把准备好的工作电极(铂电极)和参比电极(双盐桥甘汞电极)插入溶液中，准备对溶液进行电位监测。工作电极和参比电极的另一端通过放大器(instrument amplifier)连接到数据采集器(go! link)再连接至计算机。打开计算机中logger lite程序对采集时间和取样速度进行设置后，迅速点击开始键从而对溶液进行电位监测。计算机记录所采集的电位值随时间变化的曲线，即化学电位振荡图谱。当需要检测某种物质的时候，在振荡图谱达到振荡体系稳定时迅速加入，通常在第5次到第7次振荡电位处于最低电位时迅速加入。

22、振荡图谱的基本参数包括:

23、诱导时间:加入最后一种物质到溶液起振前所需要的时间。

24、振荡振幅:在振荡过程中从一个最低电位到下一个最高点位之间的电位差值。

25、振荡周期:在振荡过程中从一个最低(高)点位到下一个最低(高)点位所需时间。

26、最高电位:稳定振荡时体系出现的电位最高点。

27、最低电位:稳定振荡时体系出现的电位最低点。

28、振荡寿命:自振荡开始到振荡结束所需要的时间。

29、平衡电位:体系达到热力学平衡状态时的电位。此刻，电位不随时间的变化而变化。

30、抑制时间(tin):从加入egcg溶液振荡受到抑制开始，到重新恢复振荡所需的时间。

31、2、建立egcg样本浓度与振荡特征响应参数(抑制时间)之间关系的工作曲线

32、配制系列不同浓度的egcg溶液作为样本溶液。将配制的样本溶液加入已稳定的振荡体系中，并固定在第5次到第7次振荡、电位处于最低电位时时加入。加入的egcg会暂时抑制振荡一段时间，然后振荡恢复，也即产生了抑制时间tin，加入不同浓度的egcg会产生不同的抑制时间。振荡特征响应参数为抑制时间(tin)。

33、以抑制时间tin为纵坐标，egcg样本溶液浓度c为横坐标作图，得到在体系中egcg浓度范围在2.5×10-6mol/l 到1.25×10-5mol/l之间的工作曲线。

34、3、egcg的定量分析

35、将待测试样加入已稳定振荡的振荡体系中，(待测试样均在第5次振荡、电位处于最低电位时加入)，振荡响应为产生了抑制时间，得到tin值，根据工作曲线，可求得待测试样中的egcg的浓度。

36、本方法可以方便快捷地检测出食品或药品中的egcg的含量，实验表明，试样中的其他物质对检测无干扰。