DDX24在维持内皮细胞的核仁稳态中的应用

本发明涉及疾病治疗，更具体地，涉及ddx24在维持内皮细胞的核仁稳态中的应用。

背景技术：

1、核仁是独特的无膜核体，主要参与核糖体生物合成，并在核糖核蛋白(rnp)复合物组装、dna损伤应答、细胞周期控制和应激反应中发挥重要作用。数百种分子驻留在核仁中，组成由纤维中心(fc)、致密纤维成分(dfc)和颗粒成分(gc)构成的有序多层结构维持着核仁正常功能。核磷蛋白(npm1)是核仁颗粒成分中的标志蛋白，参与核糖体的生物合成。由于核仁各层的支架蛋白具有不同的粘弹性和表面张力特性，核仁的各亚区域间显示出不相容性并与周围核质的空间分离。gc层是一个动态结构，主要负责rrna加工和核糖体组装。gc层标志蛋白npm1的相分离行为与错误折叠蛋白的存贮和核糖体前体组装等核仁稳态功能密切相关。干扰核仁稳态可能会导致包括dead-box螺旋酶在内的大量核仁蛋白丰度的变化。这些分子在支持动态架构的同时，显示出恒定的流动性并与周围环境持续交换以维持核仁稳态。

2、细胞核仁的生物物理性质研究表明，核仁通过液-液相分离(llps)形成和维持。这个模型将核仁材料特性与其多样化的功能紧密结合。例如，当细胞处于长时间的热应激下时，核仁中蛋白质的流动性减少会破坏其恢复错误折叠蛋白的能力。核仁的这种功能障碍可能会导致疾病发生。例如，在神经退行性疾病的情况下，异常表达的二肽重复多肽破坏了npm1相分离及其在核糖体组装中的功能，从而诱导细胞毒性。这些机制性发现促使我们重新审视与核仁蛋白功能失调相关的许多疾病的病理学。

3、血管异常是一组异质性疾病，其特征是内皮细胞的增殖、迁移和生存发生改变，通常由基因突变引起。然而，核仁稳态与血管异常情况下内皮功能之间的联系仍然缺失。此前，我们发现了一种特殊类型的血管畸形，称为多器官静脉和淋巴缺陷综合征(movld)，患者表现出危及生命的症状，目前缺乏有效的治疗方法。我们的工作将ddx24的p.glu271lys突变(ddx24e271k)与这种疾病相关联，并证明ddx24功能障碍能促进内皮细胞迁移。

4、ddx24属于一个大型的atp依赖性rna解旋酶家族，其中许多成员都含有内在无序区域(idrs)，并能通过llps调控含rna的无膜细胞器。ddx24主要定位于细胞核仁，广泛表达于人类组织中，已被鉴定为细胞存活的必需基因，对小鼠胚胎发育也至关重要。尽管如此，目前尚未报道ddx24是否能发生相分离或参与维持核仁稳态。此外，ddx24突变介导的血管异常的机制仍然不明确。

技术实现思路

1、为了克服现有技术存在的上述问题，本发明首先提供核仁形态变化与内皮细胞中ddx24浓度的关系，并在此基础上研究内皮细胞核仁形态变化和血管异常之间的相关性，从而试图寻找疾病早期微小变化的生物标志物，以期在疾病的早期阶段对其进行干预和治疗。

2、本发明的目的通过以下技术方案实现：

3、本发明通过实验验证ddx24与核仁形态之间的关系，在敲低ddx24后，核仁大小增大，核仁畸形明显。值得注意的是，ddx24敲低后，ddx24的核仁/核质比率在ddx24缺乏时显著下降，这可以通过重新引入ddx24wt而不是ddx24e271k来挽救，与患者组织的发现一致。单纯过表达ddx24wt也影响了ddx24的核仁/核质比例。这些结果强调了ddx24对维持正常核仁形态的作用。因此当确定内皮细胞中ddx24的表达量，就可确定核仁形态。

4、通常，核糖体生物合成的功能障碍，称为核糖体病，是由核糖体装配因子或r蛋白的突变引起的。许多研究已经证明，核糖体生物合成的缺陷会导致5srnp的积累，它与hdm2结合并触发p53信号通路的激活。然而，最近的研究表明，核仁的液态特性对核糖体亚基的装配和转运很重要。从这个角度来看，核糖体病可能是由于核仁物质性质改变而引起的。我们的数据显示，由ddx24e271k引起的核仁内npm1流动性降低会阻碍rrna生物合成并影响核糖体大亚基的转运，导致5.8srrna在核仁中积累。此外，改变npm1相分离行为的下游效应可能汇聚到p53信号通路上，因为ddx24已被鉴定为p53的激活剂，以影响细胞功能。我们的工作增加了关于如何通过核仁募员蛋白(本文中为ddx24)调节核仁相分离行为，并最终影响核仁稳态的认识。

5、因此，本发明首先提供用于检测内皮细胞核仁中ddx24的表达量的物质在制备血管异常相关疾病的诊断功能产品中的应用。

6、本发明还提供用于检测内皮细胞核中ddx24的核仁/核质比例(即核仁中的分离常数)的物质在制备血管异常相关疾病的诊断功能产品中的应用。

7、优选的，所述血管异常相关疾病为movld综合征。

8、本发明还提供用于检测内皮细胞核仁中ddx24的表达量的物质在制备判断内皮细胞核仁形态变化的功能产品中的应用。

9、本发明还提供用于检测内皮细胞核中ddx24的核仁/核质比例(即核仁中的分离常数)的物质在制备判断内皮细胞核仁形态变化的功能产品中的应用。

10、优选的，所述用于检测内皮细胞核仁中ddx24的表达量的物质，或者用于检测内皮细胞核中ddx24的核仁/核质比例(即核仁中的分离常数)的物质为ddx24抗体。

11、优选的，所述用于检测内皮细胞核仁形态变化的物质为ddx24抗体。

12、此前，我们报道过敲低ddx24会导致内皮细胞迁移增强。在这里，我们在ddx24缺乏的内皮细胞系huvecs中外源性表达ddx24wt或ddx24e271k来拯救细胞表型。与上述npm1相分离行为变化一致，重新表达ddx24e271k几乎没有任何区别，而ddx24wt抵消了敲低ddx24时的迁移增加(图6f，g)。增强的细胞迁移也与npm1的敲低相关。总之，我们的数据阐明了ddx24在维持核仁稳态中的重要作用，即通过ddx24的突变或减少表达降低核仁支架蛋白npm1的流动性会损害核糖体生物合成，并最终影响内皮细胞的功能。

13、在目前的工作中，我们揭示了ddx24通过与npm1相互作用，作为募员蛋白维持核仁稳态。影响ddx24 llps性质的突变可以将其效应传导到npm1的相分离行为，并破坏核糖体的生物合成，最终导致血管异常。

14、movld综合征的特点是起病隐匿，病变位置较深，对常规介入治疗反应不佳，使诊断和治疗都具有挑战性。检测早期微小变化并监测疾病进展的生物标志物对于此类疾病的治疗干预至关重要。最近，核仁蛋白结构和定位的改变已成为诊断病毒感染、癌症和衰老等疾病极具应用前景的生物标志物。例如，在神经退行性疾病中，在患者组织和小鼠模型中观察到核仁肿胀和核仁蛋白转位，并与帕金森氏病和阿尔茨海默氏病相关。据我们所知，迄今为止没有研究将核仁形态与血管异常相关联。我们的结果强调了内皮细胞中杂乱的npm1染色指示的核仁形态变化和/或降低的核仁ddx24浓度作为movld综合征的潜在生物标志物。

15、因此，本发明还提供用于检测内皮细胞核仁形态变化的物质在制备诊断movld综合征的功能产品中的应用。

16、优选的，所述用于检测内皮细胞核仁形态变化的物质为ddx24抗体。

17、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

18、我们证明了ddx24在体外形成生物大分子凝聚物，突变形式ddx24e271k在movld综合征患者组织和培养的内皮细胞中进入核仁较少，改变了核仁形态。此外，ddx24直接与npm1相互作用，作为核仁颗粒成分(gc)中的募员蛋白调节其相分离行为。在功能上，我们表明，无论是突变还是敲低ddx24都会导致核糖体生物合成功能障碍，从而导致内皮细胞迁移增强。我们的发现表明了在血管畸形环境中，ddx24突变如何通过调节npm1的相分离行为影响内皮细胞的核仁结构和功能。

19、本发明研究了ddx24e271k体外和细胞内引起的核仁形态和llps性质的变化，以及由此产生的功能后果。ddx24通过控制其相关核仁蛋白npm1的相分离行为来维持核仁稳态是必要的。我们的发现揭示了血管异常的一种新机制，为这类疾病提供了有希望的诊断标记物和治疗靶点。