基于兔轮状病毒VP8*蛋白的间接ELISA抗体检测试剂盒

本发明涉及基于兔轮状病毒vp8*蛋白的间接elisa抗体检测试剂盒，属于抗体检测。

背景技术：

1、轮状病毒(rvs)，为呼肠孤病毒属双链rna病毒，可引起人和动物急性胃肠炎。1974年轮状病毒首次在实验室小鼠体内发现，后陆续在人类、猪、牛等哺乳动物及鸟类等宿主中发现。兔轮状病毒主要引起1～2月龄幼兔发生腹泻，各阶段兔均可感染。兔轮状病毒病发病迅速，发病率高，且一年四季均可发生。

2、轮状病毒基因组由11个不连续的片段组成，可编码6种结构蛋白和5种非结构蛋白，轮状病毒的主要抗原vp4可在胰蛋白酶的作用下裂解为vp8*和vp5*。vp8*在病毒进入宿主的过程中由二聚体变成三聚体发挥重要作用。vp4是重组疫苗开发的重要靶蛋白，但完整的vp4溶解性差，vp8*包含vp4蛋白的主要抗原表位且能够刺激机体产生中和抗体。目前，已有诸多针对人源、猪源、牛源rvvp8*进行亚单位疫苗、抗体制备、诊断方法等方面的研究，并取得了一定的进展，但尚未发现关于兔轮状病毒vp8*的研究。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明提供了一种基于兔轮状病毒vp8*蛋白的间接elisa抗体检测试剂盒，以实现兔轮状病毒抗体的快速检测。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种基于兔轮状病毒vp8*蛋白的间接elisa抗体检测试剂盒，包括兔轮状病毒vp8*蛋白包被的elisa板；所述兔轮状病毒vp8*蛋白包被的elisa板是以兔轮状病毒vp8*蛋白为包被抗原，以碳酸盐缓冲液为包被液制备而成的。所述兔轮状病毒vp8*蛋白的氨基酸序列如下所示，如seq id no.1所示：

4、masliyrqllnnsfttnlsdeieeigssksenvtinpgpfaqtgyapvdwgpgetndsttivpvldgpyqptnfnppieywmlfapsdkgvvaeltnnidiwlaiilvepsvpqesrtytifgqrsslmventsqtkwkfidfvkesqngtyvprdtllsetklqaamkygqrlftfigdtpnatpqergyttnnysainvtslcdfyivsrtprevcrsyinhglppmqntrnvvpval。

5、进一步地，所述兔轮状病毒vp8*蛋白是通过以下方法制备得到的：以rvz3171毒株vp4基因为模板，利用特异性引物进行pcr扩增，得到扩增产物(即兔轮状病毒vp8*蛋白的表达基因，核苷酸序列如seq id no.2所示，711bp)；将扩增产物转入工程菌得重组工程菌；培养重组工程菌，收集菌体，提纯得到兔轮状病毒vp8*蛋白。所述特异性引物包括上游引物和下游引物，核苷酸序列如下所示：

6、上游引物p1：5′-ccgctcgagatgcgccagtagac-3′，如seq id no.3所示；

7、下游引物p2：5′-cggaattctgattgtgatgtcc-3′，如seq id no.4所示；

8、兔轮状病毒vp8*蛋白的表达基因的核苷酸序列(方向5′--3′，如seq id no.2所示)：

9、atggcttcgctcatttatagacaattgcttaataattcgttcacgactaatctatctgatgaaatcgaagaaattggatcatcgaaatctgagaatgttacgataaatccaggaccatttgcacaaacaggatatgcgccagtagactggggtcctggcgaaacaaatgattcgacaacgatcgtgccggtattagatggaccataccaaccaacaaattttaatccaccaatagaatattggatgttattcgctcctagcgataagggtgtagtggctgagctgacaaataatatagatatatggttagctattattttagttgagccaagcgtacctcaagaatcaaggacatatacgatattcggccagcgaagtagtttaatggttgaaaacacgtcacaaacgaaatggaaatttattgatttcgttaaagaaagtcaaaatggtacttatgttcctagggatacacttttatcagaaacgaagctacaagctgcaatgaaatatgggcaacggttatttacgttcattggtgatacgccgaacgcaactccacaggaacgagggtatacaacaaataattatagtgctattaatgtaacgtcattatgtgatttttatattgtatcacgtactccgcgagaagtatgtagaagctacattaatcatggacttccaccaatgcaaaacacaagaaacgtagtaccggttgcgcta。

10、进一步地，所述间接elisa抗体检测试剂盒还包括以下组分：样品稀释液，浓缩洗涤液，酶结合物工作液，显色液，终止液，阳性血清对照和阴性血清对照。

11、进一步地，所述样品稀释液为含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(0.01m，ph7.4)。

12、进一步地，所述浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的磷酸盐缓冲液(0.1m，ph7.4)(pbst)。

13、进一步地，所述酶结合物工作液为hrp-羊抗兔igg。

14、进一步地，所述显色液为tmb-过氧化氢尿素溶液。

15、进一步地，所述终止液为0.31％氢氟酸溶液。

16、所述基于兔轮状病毒vp8*蛋白的间接elisa抗体检测试剂盒在检测兔轮状病毒抗体中的应用。

17、一种利用基于兔轮状病毒vp8*蛋白的间接elisa抗体检测试剂盒检测兔轮状病毒抗体的方法，包括以下步骤：

18、(1)将待检样本用样品稀释液作1:100稀释，按100μl/孔加入兔轮状病毒vp8*蛋白包被的elisa板中，同时设阴性血清对照、阳性血清对照，37℃孵育45min；

19、(2)弃去反应孔中的液体，每孔加洗涤液350μl，洗涤3～5次，每次间隔1min，拍干；

20、(3)每孔加酶结合物工作液100μl，37℃孵育45min；

21、(4)弃去反应孔中的液体，每孔加洗涤液350μl，洗涤3～5次，每次间隔1min，拍干；

22、(5)加入显色液100μl，37℃避光孵育15min；

23、(6)加终止液50μl，用酶标仪在650nm下测定各孔吸光度od值，计算并判定结果；若待检样本od650nm值与阴性对照od650nm值的比值(p/n)≥2.1，且待检样本od650nm值＞0.247，则判为阳性。

24、本发明的间接elisa抗体检测试剂盒，以合成的兔轮状病毒vp8*蛋白为包被抗原，其对于rvs抗体的特异性高，安全性好，且不含无关杂蛋白，只与rvs阳性血清特异结合，不与兔其它病毒的阳性血清发生交叉反应，具有良好的抗原性，从而使得本发明的检测试剂盒具有很高的特异性和敏感性。

25、本发明所述基于兔轮状病毒vp8*蛋白的间接elisa检测试剂盒可对rvs抗体水平作出评价，适合批量样品的检测，操作简便、快速，大大提高了兔轮状病毒血清学诊断的速度。本发明利用基因工程技术表达当前兔轮状病毒流行毒株的vp8*蛋白作为包被抗原，建立了抗体检测elisa方法，可实现对兔轮状病毒抗体的高通量检测，为兔轮状病毒的综合防控提供了技术支撑。