高效液相色谱串联质谱检测血液中11种脂肪酸的总脂肪酸含量的方法和应用与流程

本发明涉及脂肪酸检测，尤其涉及一种高效液相色谱串联质谱检测血液中11种脂肪酸的总脂肪酸含量的方法和应用。

背景技术：

1、脂肪酸(fatty acids，fas)是指一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链，是构成人体脂肪的基本物质，是细胞膜磷脂的重要成分，是激素及免疫活性物质的前体，是维持人体正常生长发育及各器官正常生理功能的一系列必要物质。尤其是各项必需脂肪酸，在体内不能合成或合成速度远不能适应机体需要，必需由食物供给，容易出现不足，导致疾病发生，尤其是婴幼儿更容易出现必需脂肪酸缺乏症。

2、长链多不饱和脂肪酸是正常发育所必需的。亚油酸(c18:2ω6)和α-亚麻酸(c18:3ω3)缺乏通常是由膳食中脂肪摄入不足或肠道吸收不良引起的。长链多不饱和脂肪酸的缺乏也可能是由于亚油酸和α-亚麻酸分别对花生四烯酸和二十二碳六烯酸的延伸能力受损。血浆中c18:2ω6和c18:3ω3水平降低和/或比例升高可能在可识别的临床表现出现之前被检测到，并通过适当的营养补充进行治疗。检测血清中脂肪酸对评估婴幼儿营养摄入及吸收，检测婴幼儿体内必需及重要脂肪酸缺乏；监测代谢紊乱患者脂肪酸药物摄入情况；监测肥胖、糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病等疾病具有重要意义。

3、血浆或血清中只有一小部分脂肪酸以非酯化脂肪酸形式，即游离脂肪酸的形式存在，大多数与蛋白质结合或酯化成高阶脂质结构，如甘油三酯和磷脂。总脂肪酸的检测需要先将酯化脂肪酸水解为非酯化脂肪酸，再对非酯化脂肪酸进行检测。血浆或血清中总脂肪酸(游离和酯化)的定量在临床上对于必需脂肪酸缺乏(essential fatty aciddeficiency)的诊断，以及评估营养状况具有重要作用。监测总脂肪酸水平对于因早产、长期肠外营养、吸收不良或严重肝损伤而增加必需脂肪酸缺乏风险的个体，以及患有遗传性疾病的患者具有重要意义。

4、鉴于脂肪酸对人类健康的临床意义，多年来脂肪酸分析一直是人们感兴趣的领域。检测方法包括气相色谱法(gc)、气相色谱串联质谱法(gc-ms/ms)、液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)等，其中使用最多的方法是gc-ms/ms，现在也有一些lc-ms/ms方法检测脂肪酸，lc-ms/ms方法用于检测脂肪酸具有较好的敏感性，但一般为了降低极性和增加挥发性，会将脂肪酸衍生化形成甲酯(fames)或五氟苯酯(pfb-fas)再进行检测，脂肪酸检测常规技术路径如图1所示。

5、现有技术中也有一些用于检测人血液中脂肪酸，但都是游离脂肪酸的lc-ms/ms方法，没有总脂肪酸的lc-ms/ms方法。中国专利cn 114965755 a公开了一种血液中omega-3和omega-6多不饱和游离脂肪酸的检测方法和试剂盒，该试剂盒用于监测血清中游离omega-3和omega-6脂肪酸，虽然分析时间短，但是c18：2ω6的正确度不合格，而且前处理所需容器均为玻璃材质，人员技术操作要求高，同时玻璃容器若一次性使用成本高，若反复清洗使用有污染样本的可能，因此该方法不利于大批量样本检测。cn 111830163 a公开了一种超高效液相色谱串联质谱检测血清中18种脂肪酸的方法，该方法用到超高效液相色谱，仪器成本高，而且精密度和回收率较差，批间精密度可达16.13％，回收率可达112.3％。cn113325100 a公开了一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法及其应用，虽然该方法检测种类较多，但该方法用到10mmol/l的高浓度氟化铵，容易积聚，腐蚀液相管路，在检测器中蓄积对仪器损伤较大，影响仪器灵敏度和噪音，而且高温下氟化铵易产生危险的氟化氢气体，存在安全隐患。同时该方法检测所需样本量较多，样本采集人员依从性差对易缺乏脂肪酸的婴幼儿不友好。此外以上方法存在基质效应，需要用空白基质配制标准曲线，试剂成本高，工作液的配制及长期保管存在风险。

6、因此，亟待开发一种人员技术操作简单，安全系数高，成本低，样本采集人员依从性高的，适用于大批量同时测定血清中多种脂肪酸的总脂肪酸含量的方法。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高效液相色谱串联质谱检测血液中11种脂肪酸的总脂肪酸含量的方法。

2、本发明提供了一种高效液相色谱串联质谱检测血液中11种脂肪酸的总脂肪酸含量的方法，总脂肪酸包括血液中的非酯化脂肪酸和酯化脂肪酸，非酯化脂肪酸即游离脂肪酸，11种脂肪酸包括：α-亚麻酸、γ-亚麻酸、油酸、亚油酸、棕榈油酸、巨头鲸鱼酸、花生四烯酸、顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、全顺式-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸和全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸；本发明的方法至少包括以下步骤，图2为方法步骤的流程图：

3、s1、制备标准曲线方程，包括：配制系列浓度的标准工作液和内标工作液；标准工作液中含有11种脂肪酸的标准品；内标工作液中含有脂肪酸的内标物；将标准工作液、内标工作液和稀释液混合后得到含有不同脂肪酸浓度的标准溶液；稀释液选自含0.05～0.3％氨水的乙腈；将标准溶液采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测，获得标准曲线方程；

4、s2、处理得到待测样本，包括：

5、s21、取待测血清加入内标工作液后对酯化脂肪酸进行酸水解和碱水解，得到水解产物；

6、s22、将水解产物加入萃取剂进行混合，离心得第一上清液，干燥后加入复溶液复溶，离心得第二上清液为待测样本；复溶液选自含0.05～0.3％氨水的乙腈；

7、s3、检测待测样本，包括：使用高效液相色谱质谱联用仪对待测样本进行检测，将检测结果代入标准曲线方程，得到待测样本中11种脂肪酸的总脂肪酸含量。

8、本发明还提供了上述方法在检测11种脂肪酸在血液中的总脂肪酸含量中的应用。

9、本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

10、本发明使用的样本量只有10μl，对于易出现脂肪酸缺乏，但又难以采集到足够血液的婴幼儿较友好。

11、本发明检测方法血清经水解释放结合的脂肪酸，后液液萃取脂肪酸，吹干复溶后直接进样，检测过程简便快速。水解时间缩短，水解温度降低，避免了长时高温加热有机试剂的危害；而且不需要衍生化处理，简化了前处理步骤，避免了衍生化试剂的毒性危害。本前处理方法总体上降低了实验成本，缩短了分析时间，提高了安全性，更利于大通量的样本检测。

12、本发明采用的离子对母离子和子离子一致，均为准分子离子，克服了碎裂离子易受条件影响不发生碎裂或响应降低的缺陷，使检测更加可靠和准确。

13、本发明检测方法简化了标曲的制备方法，不需要添加基质进行前处理，无基质效应。标准工作液稳定性好，无需每次检测都制备标准工作液，只需对标准工作液进行简单稀释即可。使整体过程更简便，前处理时长更短。

14、本发明的检测方法线性范围宽、线性范围设定全面，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。