一种鲤疱疹病毒II型抗体胶体金检测试纸条及其制备方法和应用

本发明属于分子体外诊断，具体涉及一种鲤疱疹病毒ii型抗体胶体金检测试纸条及其制备方法和在鲤科鱼类感染疱疹病毒ii型(cyhv-2)病毒的检测和鲤科鱼类igm抗体水平的监测的应用。

背景技术：

1、鲤疱疹病毒ⅱ型(cyprinid herpesvirus-2，cyhv-2)为金鱼和鲫的疱疹病毒性造血坏死(herpesviral haematopoietic necrosis,hvhn)的病原体。cyhv-2有一个含有双链dna基因组的二十面体衣壳和一个携带病毒糖蛋白的脂质包膜。病毒在脾脏和肾脏的造血细胞以及受感染鱼类的鳃中繁殖和组装。cyhv-2对金鱼、鲫甚至金鱼和鲤鱼的杂交种都具有高致病性。cyhv-2是疱疹病毒目异疱疹病毒科鲤鱼病毒属下的一个成员，其他属于该属的病毒包括鲤疱疹病毒ⅰ型、鲤疱疹病毒ⅲ型。

2、cyhv-2的抗体可以通过酶联免疫标记(enzyme linked immunosorbent assay,elisa)、免疫荧光技术、免疫胶体金电镜技术等进行检测。这些方法具有高灵敏度、强特异性，可用于定性或半微量、微量和超微量定量分析。然而，在实际应用中，上述免疫实验需要专业人员进行操作，并且对特异性抗体的要求高，检测仪器设备比较复杂，检测时间长。这些弊端的存在体现了快速简便的临床检测方法开发的必要性和重要性。胶体金免疫层析试纸条技术(colloidal gold immunochromatography assay，gica)将胶体金标记技术、免疫检测技术、层析分析技术和单(多)克隆抗体技术等多种技术相结合，具有特异性高、反应迅速、操作简单、成本低等特点。gica技术已成功应用于妊娠检测、病原体抗体检测、病原检测、疾病相关的标志物检测、药物残留检测等诸多领域。胶体金试纸条中免疫复合物将被截留或富集在检测带上，标记物(胶体金)会呈现直观的显色试验现象；若样品中不含待检物，则会同游离标记物一起到达质控线，结果非常直观易懂。胶体金免疫层析试纸条具有价格低廉、不需要专业人员操作、检测快捷和特异性强的优点。因此gica技术特别适用于水产养殖临床检测。

3、胶体金免疫层析试验(gica)使用硝酸纤维素膜(nc)作为载体，胶体金标记的抗原或抗体作为示踪剂。胶体金免疫层析试纸条具有价格低廉、操作简便、检测快捷和特异性强的优点，这种检测已被用于新冠肺炎病毒抗原的诊断。目前，gica技术已被广泛应用于妊娠检测、病原体抗体和抗原检测、疾病相关的蛋白检测等。gica技术已经成为目前动物医学快速检测中最快速、敏感的免疫学检测方法之一。由于该技术具有成的免疫复合物将被截留或富集在检测带上，标记物(胶体金)会呈现直观的显色试验现象。若样品中不含待检物，则会同游离标记物一起到达质控线。

4、鲤疱疹病毒ⅱ型的抗体可以通过酶联免疫标记、免疫荧光技术、免疫胶体金电镜技术等进行检测。这些方法具有高灵敏度、强特异性，可用于定性或半微量、微量和超微量定量分析。然而，在实际应用中，上述免疫实验需要专业人员进行操作，并且对特异性抗体的要求高，检测仪器设备比较复杂，检测时间长。这些弊端的存在体现了快速简便的临床检测方法开发的必要性和重要性。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明提供一种检测鲤疱疹病毒ⅱ型(cyhv-2)抗体胶体金试纸条及其制备方法和应用，创造性的将cyhv-2与胶体金结合作为金标抗原、proteina作为检测线、兔源rorf66多克隆抗体作为质控线。分析胶体金试纸条最佳制备及组装条件，确定了胶体金标记最适ph、金标抗原最适浓度，以及检测线、质控线最适划线浓度等。本发明制备的cyhv-2抗体胶体金试纸条可以使用全血测试，与常见的其他鱼类病毒血清没有交叉反应，如草鱼呼肠孤病毒血清、鳜虹彩病毒血清、大口黑鲈虹彩病毒血清、鲤春病毒血症病毒血清。试纸条最低限度可以检测到1：100稀释的阳性血清抗体，由试纸条检测线的深浅可以初步判断鱼体中抗体水平。

2、为实现上述目的，本发明所采取的解决方案如下：

3、第一方面，本发明提供一种鲤疱疹病毒ii型抗体胶体金检测试纸条，包括载体、固定在所述载体上的硝酸纤维膜、用于承载胶体金的金标垫和用于承载样品溶液的样品垫，所述硝酸纤维膜上包覆有间隔设置的检测线和质控线，所述金标垫包括含有胶体金溶液和鲤疱疹病毒ii型病毒液的金标抗原溶液，所述检测线包括protein a，所述质控线包括兔源rorf66多克隆抗体。

4、第二方面，本发明还提供一种如上所述的鲤疱疹病毒ii型抗体胶体金检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

5、扩增鲤疱疹病毒ii型(cyhv-2)病毒，获得cyhv-2病毒液；

6、制备鲫鱼阳性血清；

7、制备胶体金溶液；

8、制备胶体金标记cyhv-2病毒抗原溶液；

9、确定质控线最适划线浓度；

10、确定检测线最适划线浓度；

11、组装试纸条。

12、优选地，扩增鲤疱疹病毒ii型(cyhv-2)病毒的步骤包括：将保存在-150℃的cyhv-2病毒化冻，选取在27℃细胞培养箱生长1-2天的鲫鳍条细胞系(gicf)细胞，用显微镜观察生长状态，细胞长为单层且状态较好时，开始接种病毒；先用移液管吸出t75培养瓶中的培养液，加入化冻的cyhv-2病毒液，25℃孵育2h，然后吸出病毒液，加入含2％胎牛血清的m199培养基；放置于25℃细胞培养箱，待出现细胞病变效应，继续培养1-2天，使病毒充分释放于培养液中；用离心管收集病毒液并在800rpm离心5min，以此去除细胞碎片，上清液使用0.22μm过滤膜过滤，提取dna进行qpcr以确定病毒载量，病毒保存至-150℃冰箱备用。

13、优选地，制备鲫鱼阳性血清的步骤包括：将长度为14-16cm的健康鲫鱼暂养7天，确认无病毒或其他病原感染，取10条鲫鱼，每条鲫鱼腹腔注射500μl 109copies/ml的cyhv-2病毒液，然后放入20l曝氧水以及保持25℃温度的玻璃缸；待21天后每条鲫鱼尾静脉抽血，血液放入离心管中，4℃静置一夜；然后解剖鲫鱼，取肾、脾、肝胰脏，提取病毒dna并进行pcr，产物使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，组织保存于-20℃；第二天将血样品800rpm离心5min，吸取血清移入新的离心管中，吸取的血清进行dot blot检测抗体效价，血清保存于-20℃。

14、优选地，所述鲫鱼阳性血清的抗体效价为1：320。

15、优选地，制备胶体金溶液的步骤包括：首先将玻璃容器清洗干净，加入浓度为0.01％的氯金酸溶液，置于加热磁力搅拌器上加热搅拌，待溶液彻底煮沸3min后迅速加入1％柠檬酸三钠溶液，搅拌并持续加热，溶液变黑再变紫红色后，继续加热10min待反应完全，待冷却后补充到原体积，此时溶液呈酒红色，用分光光度计以及透射电镜进行质量鉴定，得到胶体金颗粒的平均粒径在15-25nm的胶体金溶液。

16、优选地，制备胶体金标记cyhv-2病毒抗原溶液的步骤包括：用0.2mol/l k2co3溶液将6管胶体金溶液分别调节ph至4～9，在不同ph溶液中加入适量的cyhv-2病毒液，充分混合均匀静置30min后，加入10％nacl溶液，混合均匀静置2h，使用分光光度计测定每个ph梯度在520nm处的od值；将6管胶体金溶液调节至最适ph，分别向胶体金溶液中加入15μl、30μl、45μl、60μl、75μl、90μl的cyhv-2病毒液，混合均匀后静止30min，随即加入0.1ml10％nacl溶液混合均匀后，静置2h，使用分光光度计检测每个浓度在520nm处od值；取800μl胶体金溶液于离心管中，将离心管置于冰上操作，调节至最适ph，涡旋3min，静置3min；向胶体金溶液中加入最适标记量120％的cyhv-2病毒液，涡旋3min，静置3min；加入5％bsa溶液(1x pbs配置)使bsa终浓度为1％，涡旋3min，静置3min；然后在4℃下，1500rpm离心20min；观察无沉淀则效果良好，继续4℃，8000～9900rpm离心30min；此时胶体金沉淀于底部，吸除上清，沉淀取用1/10体积作为金标复溶液重悬，保存至4℃。

17、优选地，确定质控线最适划线浓度的步骤包括：取硝酸纤维素膜，将兔源rorf66多克隆抗体稀释成1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mg/ml依次划线，组装成试纸条，检测阴性血清和阳性血清，15min后根据显色情况确定质控线最适划线浓度。

18、优选地，确定检测线最适划线浓度：取硝酸纤维素膜，将protein a稀释成1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mg/ml依次划线，组装成试纸条，检测阴性血清和阳性血清，15min后根据显色情况确定检测线最适划线浓度。

19、优选地，组装试纸条的步骤包括：

20、步骤(1)、将金标垫用裁条机切割成9mm的细条，用0.01mol/l含2％tween-20、5％海藻糖的pbs缓冲液的预处理液(ph＝7.4)浸泡30min，37℃干燥箱烘干1h，收于干燥袋中备用；

21、步骤(2)、将样品垫用裁条机切割成15mm的细条，用0.01mol/l含0.2％tritionx-100的pbs缓冲液的预处理液(ph＝7.4)浸泡30min，37℃干燥箱烘干1h，收于干燥袋中备用；

22、步骤(3)、将吸水纸用裁条机切割成17mm的细条，收于干燥袋中备用；

23、步骤(4)、用xyz三维划膜喷金仪对硝酸纤维素膜进行划线，用protein a溶液在检测线处划线，用rorf66多克隆抗体在质控线处划线，置于37℃干燥箱干燥1h；

24、步骤(5)、用制备好的金标抗原溶液滴加到金标垫上，浸润金标垫，置于37℃干燥箱干燥1h；

25、步骤(6)、取pvc底板置于贴条机上，依次组装，重叠2mm固定在pvc底板上，将贴好的试纸板用裁条机切成4.2mm宽的试纸条。

26、第三方面，本发明还提供一种如上所述的鲤疱疹病毒ii型抗体胶体金检测试纸条在鲤科鱼类感染疱疹病毒ii型(cyhv-2)病毒的检测和鲤科鱼类igm抗体水平的监测的应用。

27、优选地，所述鲤疱疹病毒ii型抗体胶体金检测试纸条检测的最低限度为1：100稀释的cyhv-2阳性血清抗体。

28、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

29、本发明采用病毒抗原、多克隆抗体等材料开发了一种适用于检测cyhv-2抗体胶体金免疫层析试纸条，使用全血样本快速检测鲫鱼体内的抗体水平，本发明将胶体金免疫层析试纸条成功应用于cyhv-2抗体的检测，能够实现cyhv-2的临床现场快速检测，并且能够对cyhv-2抗体的监测起着重要作用。