一种检测ADP的免疫比浊试剂盒的制作方法

本发明涉及脂联素(adp)检测试剂盒，具体为一种检测adp的免疫比浊试剂盒。

背景技术：

1、脂联素(adiponectin)又被称为adp、acrp30、adipoq、apm1或gbp28，是脂肪细胞分泌的脂类或糖类代谢的重要调控因子。adp在血液循环中以低分子量三聚体、六聚体和高分子量复合体形式存在，高分子量复合体是adp代谢作用的主要活性形式。临床研究发现，正常人血循环中含有丰富的脂联素，其血浆总脂联素浓度为3～30.0mg/l，约占血浆蛋白总量的0.01％。肥胖、糖尿病及冠心病患者脂联素水平显著降低，是冠心病发病的独立危险因素。脂联素是最新发现由脂肪细胞特异性高表达并分泌到血清中的特殊蛋白质，因其具有抗糖尿病、抗动脉粥样硬化、抗炎症、防止肝纤维化、抑制肿瘤生长，影响骨代谢等重要特性，已成为国内外学者研究的热点。

2、脂联素是新近发现的糖尿病预测指标，低血清脂联素水平说明个体糖尿病患病风险高。动态监测血清脂联素水平可能了解ⅱ型糖尿病的发展程度，低脂联素水平是排除年龄、血压、血脂、吸烟等因素之外的糖尿病风险预测独立指标。检测脂联素可确定糖尿病高风险人群，并进行生活管理，能够有效降低ⅱ型糖病发风险。因此，脂联素的临床检测具有巨大的市场潜力。

3、目前市场上出现的脂联素检测试剂盒有酶联免疫法、化学发光法和胶乳免疫比浊法检测试剂盒等等。酶联免疫法操作步骤繁琐，检测时间长，灵敏度和线性范围有一定局限，不能批量测试；化学发光法需要昂贵的仪器配套，检测用时较长；而作为ⅱ型糖尿病的早期预测指标，胶乳免疫比浊法试剂盒配套全自动生化分析仪或特定蛋白分析仪，能实现高通量、快速测试，同时又能兼顾精密度和灵敏度高的优点，有很大市场前景。

4、现有技术方案：脂联素胶乳免疫比浊法检测试剂盒基于样本中的脂联素与包被于胶乳颗粒的特异性抗脂联素抗体相结合，引起凝集反应。凝集反应的浊度高低与样本中脂联素浓度成正比。该方法是一种无需预处理样本，技术和设备要求不高，而精密度和特异性更高的分析方法。由于该方法不需要昂贵的设备，可以实现自动化，且可同时测定大量标本，因此受到临床广泛推广。但是市售的胶乳免疫比浊法脂联素检测试剂盒血清血浆样本测值差异大，批间差大，稳定性不好，因而限制了其在临床上的推广应用。

5、本发明引用下述参考文献：

6、(1)北京化工大学在2021年刊出的符含月的硕士研究生学位论文《季戊四醇四(3-巯基丙酸)酯的合成及应用研究》公开了季戊四醇四(3-巯基丙酸)酯的结构和合成方法；

7、(2)北京化工大学在2022年刊出的宋妍妍的硕士研究生学位论文《tpu/sir体系的poss粒子增容及反应性共混材料的制备》公开了八巯基笼型聚倍半硅氧烷(poss-sh)的结构和合成方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中脂联素胶乳免疫比浊法检测试剂盒存在血清血浆测值差异大、试剂批间差大、稳定性差的技术问题，本发明提供了一种检测adp的免疫比浊试剂盒，所述试剂盒包括：

2、r1试剂，包括：缓冲液、10～100mmol/l；nacl、0.1～1mol/l；抗凝剂、10～100mmol/l；促聚剂、0.1～1％；表面活性剂、0.1～1g/l；防腐剂、0.5～1g/l；阻断剂、0.05～0.2mg/ml；

3、其中，r1试剂中抗凝剂为edta-na2、肝素钠、柠檬酸钠中的一种或者其组合；

4、r2试剂，包括：缓冲液和抗体包被的胶乳微球；其制备过程需要交联液，封闭液和保存液；

5、校准品，包括：脂联素抗原和稀释液，浓度依次为：0、5、10、20、40μg/ml；

6、优选的，所述r1试剂包括：吗啉乙磺酸(mes)缓冲液、50mmol/l，ph＝6.0；nacl、0.65mol/l；edta-na2、20mmol/l；肝素钠、20mmol/l；柠檬酸钠、20mmol/l；增凝剂peg20000、4.5g/l；表面活性剂brijl23、0.1g/l；防腐剂nan3、1.0g/l；阻断剂、0.05mg/ml；所述阻断剂可以是igg阻断剂、罗氏阻断剂或scantibody阻断剂。

7、r1试剂中高浓度nacl与抗凝剂联合使用可有效降低血清和血浆样本的测值差异；

8、r2试剂中所述抗体包被的胶乳微球为聚苯乙烯乳胶微球-脂联素抗体复合物；所述聚苯乙烯乳胶微球粒径为200-400nm；

9、优选的，r2试剂中所述缓冲液包括甘氨酸(gly)缓冲液，ph为7.0～8.0；交联液包括50-100mmol/l hepes缓冲液，ph为6.0～8.0；封闭液组成为50-100mmol/lgly缓冲液，ph为7.0～10.0，6-12％aeo7，1-5％aeo3。

10、在本发明的一些具体实施方案中，r2试剂制备过程中特定范围的交联体系(胶乳，交联液和封闭液的比例)可有效控制批间差。

11、在本发明的一些具体实施方案中，r2试剂制备过程所需的封闭液在高ph条件下与aeo7和aeo3联合使用可提高试剂的稳定性。

12、在本发明的一些具体实施方案中，r2试剂制备过程所需的保存液组成为50-100mmol/l gly缓冲液，ph为7.0～8.0，0.1-1％bsa，6-12％蔗糖，0.05-0.1％nan3。

13、在本发明的一些具体实施方案中，所述抗体包被的胶乳微球需经过37℃老化处理1～3d。

14、本发明还提供了检测脂联素的胶乳免疫比浊法试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

15、1)试剂r1的制备：

16、按配方称取mes、聚乙二醇20000、氯化钠、edta-na2、肝素钠、柠檬酸钠、brijl35、nan3、阻断剂兔igg于洁净容器中，加去离子水搅拌30min，使其充分溶解，调节ph至6.00；加入去离子水定容，过滤得试剂r1。

17、2)试剂r2的制备：

18、步骤1：将粒径325nm固含量10％的羧基化聚苯乙烯乳胶微球加入到交联液使其浓度为0.77％；

19、步骤2：向上述乳胶微球中分别加入2倍活化量edc，37℃下搅拌反应0.5h；

20、步骤3：将脂联素抗体1、2分别加入到上述活化后的聚苯乙烯乳胶微球中，37℃搅拌反应2h；

21、步骤4：加入封闭液，使聚苯乙烯胶乳微球溶液的浓度为0.44％，37度封闭过夜；

22、步骤5：离心清洗3次，加入保存液超声分散沉淀物；将两组胶乳混合均匀得r2；

23、步骤6：将上述r2放置37℃老化处理1～3d，即得最终r2试剂。

24、本发明合成一种可替代肝素钠的新型抗凝剂，其具体合成过程如下：

25、所述r1试剂中的肝素钠可使用磺酸基-聚乙二醇mpeg-so3h替代；

26、其中，磺酸基-聚乙二醇mpeg-so3h的制备方法如下：

27、步骤s1，合成烯丙基-聚乙二醇mpeg-ch2-ch＝ch2：通过聚乙二醇mpeg-oh末端的羟基官能团与烯丙基缩水甘油醚的环氧官能团在碱性催化剂作用下发生开环反应，生成烯丙基-聚乙二醇mpeg-ch2-ch＝ch2；

28、步骤s2，合成巯基-聚乙二醇mpeg-sh：利用巯基-烯点击反应机理，通过烯丙基-聚乙二醇mpeg-ch2-ch＝ch2的烯丙基官能团与巯基化试剂的巯基官能团发生巯基-烯点击化学反应，生成巯基-聚乙二醇mpeg-sh；

29、步骤s3，合成磺酸基-聚乙二醇mpeg-so3h：利用过氧化氢作为氧化试剂，把巯基-聚乙二醇mpeg-sh的巯基官能团氧化为磺酸基官能团，制备得到磺酸基-聚乙二醇mpeg-so3h。

30、优选的，所述巯基化试剂为季戊四醇四(3-巯基丙酸)酯、八巯基笼型聚倍半硅氧烷poss-sh中的一种或者组合。

31、优选的，所述磺酸基-聚乙二醇mpeg-so3h为mpeg-so3h-ⅰ、mpeg-so3h-ⅱ中的一种或者组合。

32、与现有技术相比，本发明具备以下有益的技术效果：

33、(1)试剂r1中高浓度的nacl和抗凝剂联合使用能够降低血清和血浆的测值差异；

34、(2)试剂r2制备过程中控制交联体系的大小(加完交联液后微球浓度为0.77％，加完封闭液后微球浓度为0.44％)能够减小试剂盒的批间差；

35、(3)使用高ph且添加有9％aeo7与3％aeo3的封闭液能够提高试剂盒的稳定性；

36、本发明提供了一种能够降低血清血浆测值差异、减小批间差、改善稳定性的检测adp免疫比浊试剂盒。