同时检测6种免疫抑制剂浓度的液相色谱-质谱分析方法与流程

本公开涉及血药检测，尤其涉及一种同时检测6种免疫抑制剂浓度的液相色谱-质谱分析方法。

背景技术：

1、目前测定血液中硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、6-甲基巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤核苷、咪唑立宾等免疫抑制剂的含量通常可以采用高效液相色谱质谱联用法，但是并没有同时检测上述物质的方法，同时，已被报道的文献方法大多存在着样品量需求较大，标准曲线前处理需添加基质、单物质检测等问题，上述问题会增加检测难度降低检测效率，尚不适于大通量的样本检测。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本公开提供了一种同时检测6种免疫抑制剂浓度的液相色谱-质谱分析方法。

2、第一方面，本公开提供了一种同时检测6种免疫抑制剂浓度的液相色谱-质谱分析方法，所述液相色谱-质谱分析方法包括：

3、(1)配制至少三种不同浓度的含有6种免疫抑制剂的标准溶液，并利用液相色谱-质谱对所述标准溶液进行检测，根据检测结果分别建立所述6种免疫抑制剂的标准曲线；

4、其中，所述6种免疫抑制剂为硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、6-甲基巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤核苷和咪唑立宾；

5、(2)利用液相色谱-质谱对待测样品进行检测，根据检测结果和所述标准曲线确定所述待测样品中6种免疫抑制剂的含量。

6、本公开提供的检测方法能够一针测得6种免疫抑制剂的含量，检测时间短，在5min以内出结果，提高检测效率的同时降低操作难度，适用于高通量样本的检测。

7、作为本公开的一种优选技术方案，所述液相色谱的条件包括：

8、流动相：a相为含有0.2-3％甲酸、1-10mmol/l甲酸铵或乙酸铵的水溶液，b相为甲醇或乙腈；

9、所述0.2-3％甲酸可以为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％等；所述1-10mmol/l可以为2mmol/l、4mmol/l、6mmol/l、8mmol/l等。

10、梯度洗脱：

11、0.00min：a相85-98％，b相15-2％；

12、0.50min：a相85-98％，b相15-2％；

13、0.60min：a相50-75％，b相50-25％；

14、1.20min：a相50-75％，b相50-25％；

15、1.50min：a相25-45％，b相75-55％；

16、2.00min：a相25-45％，b相75-55％；

17、2.50min：a相2-20％，b相98-80％；

18、3.00min：a相2-20％，b相98-80％；

19、3.10min：a相85-98％，b相15-2％；

20、5.00min：a相85-98％，b相15-2％。

21、在梯度洗脱条件中，对于0.00-0.50min，a相可以为86％、88％、90％、92％、95％、97％等，b相可以为14％、12％、10％、8％、5％、3％等。

22、对于0.60-1.20min，a相可以为52％、55％、58％、60％、62％、65％、68％、70％、72％等，b相可以为48％、45％、42％、40％、38％、35％、32％、30％、28％等。

23、对于1.50-2.00min，a相可以为28％、30％、32％、35％、38％、40％、42％等，b相可以为72％、70％、68％、65％、62％、60％、58％等。

24、对于2.50-3.00min，a相可以为5％、8％、10％、12％、15％、18％等，b相可以为95％、92％、90％、88％、85％、82％等。

25、对于3.10-5.00min，a相可以为86％、88％、90％、92％、95％、97％等，b相可以为14％、12％、10％、8％、5％、3％等。

26、作为本公开的一种优选技术方案，所述液相色谱的条件包括：柱温为35-40℃，例如36℃、37℃、38℃、39℃等。

27、作为本公开的一种优选技术方案，所述流动相的流速为0.3-0.5ml/min，例如0.35ml/min、0.4ml/min、0.45ml/min等。

28、作为本公开的一种优选技术方案，所述液相色谱使用的分析色谱柱为agilentporoshell 120ec-c18、phenomenex kinetex、waters cortecs t3、岛津shim-pack veioxc18。

29、作为本公开的一种优选技术方案，所述质谱的条件包括：离子源温度：450-500℃，例如460℃、470℃、480℃、490℃等；离子源高压：4500-5000v，例如4600v、4700v、4800v、4900v等；气帘气：12-20l/min，例如14l/min、15l/min、16l/min、18l/min等；碰撞气：7-10l/min，例如8l/min、9l/min等；干燥气1：30-80l/min，例如40l/min、50l/min、60l/min、70l/min等；干燥气2：30-80l/min，例如40l/min、50l/min、60l/min、70l/min。

30、本公开提供的检测方法中，咪唑立宾采用正离子模式，且正离子信号较好较高，能够满足定量要求的同时降低对仪器的要求，能够与其他5种免疫抑制剂同时检测，能够减少检测程序，提高检测效率。本公开限定的检测条件能够得到良好的色谱峰形，且色谱分离，避免离子串扰并有效降低基质效应。

31、作为本公开的一种优选技术方案，所述标准溶液中还含有6种免疫抑制剂的内标物。

32、作为本公开的一种优选技术方案，所述待测样本中含有6种免疫抑制剂的内标物。

33、作为本公开的一种优选技术方案，所述待测样本中的6种免疫抑制剂的内标物与所述标准溶液中的6种免疫抑制剂的内标物的浓度相同。

34、作为本公开的一种优选技术方案，所述6种免疫抑制剂的内标物分别为硫唑嘌呤-d3、6-甲基巯基嘌呤-d3、6-巯基嘌呤-13c,15n2。

35、作为本公开的一种优选技术方案，所述硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤核苷和咪唑立宾对应的内标为硫唑嘌呤-d3；所述6-甲基巯基嘌呤和6-硫鸟嘌呤对应的内标为6-甲基巯基嘌呤-d3；所述6-巯基嘌呤对应的内标为6-巯基嘌呤-13c,15n2。

36、通过本公开限定的样品前处理条件，能够使得在仅使用3种内标物的前提下完成样品检测，节约了内标成本，且简化了前处理难度。

37、作为本公开的一种优选技术方案，所述标准溶液的制备方法包括：制备至少三个级别浓度的标准工作液，标准工作液、内标工作液和蛋白沉淀剂混合，取上清液进行稀释，得到所述标准溶液。

38、在制备标准溶液的过程中，为了充分模拟样品前处理过程，可以加入部分纯水，以标准工作液+水的形式可以认为是待测血浆。

39、作为本公开的一种优选技术方案，各所述级别浓度的标准工作液均利用稀释剂由标准品母液稀释得到，所述标准品母液是利用溶剂分别溶解所述6种免疫抑制剂各自的标准品得到。

40、所述内标工作液利用稀释剂由内标母液稀释得到，所述内标母液是利用溶剂分别溶解所述6种免疫抑制剂各自的内标物标准品得到。

41、作为本公开的一种优选技术方案，所述稀释剂为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液的浓度为60-80％，所述60-80％可以为65％、70％、75％、80％等。

42、本公开实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

43、(1)本公开提供的检测方法能够一针测得6种免疫抑制剂的含量结果，检测时间短，在5min以内出结果，提高检测效率的同时降低操作难度，适用于高通量样本的检测；

44、(2)本公开提供的检测方法能够减少杂质干扰、降低残留、降低基质效应，使6个物质在只使用3个同位素内标，且标曲还不添加基质前处理的条件下完成检测。