一种检测蜂蜜中耐高渗接合酵母属的标志物和方法

本发明涉及食品质量检测，尤其涉及一种检测蜂蜜中耐高渗接合酵母属的标志物和方法。

背景技术：

1、蜂蜜渗透压高、ph低且含有大量酚类抑菌物质，除耐高渗酵母外的大多数微生物均难以在其中生存。耐高渗酵母污染早期较难发现，在污染中后期会引起蜂蜜风味及营养价值改变，导致产品严重腐败，因此其污染不但会对企业造成经济损失，也会严重影响进出口贸易。cac标准规定蜂蜜在储存、销售及运输中不得发酵及发生风味改变，因此耐高渗酵母被列为需要控制的重要腐败菌之一，近年来已被列为蜂蜜进出口检验的重要检测指标。

2、现阶段针对蜂蜜中耐高渗酵母检测方法主要为平板检测法，该方法耗时长，在污染初期阶段容易因为操作问题出现假阴性等问题。液质联用(hplc-ms)法准确度高，但检测对象主要为酵母发酵的次级代谢产物，往往检出时产品已严重腐败。顶空-固相微萃取-气质联用(hs-spme-gc–ms)可以克服上述方法耗时长、成本高、检测环境及人员要求高等缺点，以其准确、灵敏、快速、易操作等特点，在食品品质及安全快速检测领域中显示出巨大的发展潜力。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供丁酸甲酯和2-甲基-3-戊酮在作为检测蜂蜜中耐高渗接合酵母属的标志物中的应用。

2、本发明通过大量研究得到了蜂蜜中最常见的耐高渗酵母——接合酵母属(zygosaccharomyces spp)的两个标志物，丁酸甲酯和2-甲基-3-戊酮。通过对这两种物质进行定性或定量检测可以有效反映出蜂蜜中耐高渗酵母的水平。

3、其中，丁酸甲酯，分子式为c5h10o2，熔点为-85℃，沸点103℃，常温下是无色透明液体，呈苹果和干酪香气，浓度低于100mg/kg时呈香蕉和菠萝香气。混溶于乙醇和乙醚，微溶于水(1：60)。天然存在于圆柚汁、苹果汁、菠萝蜜、猕猴桃、蘑菇等中。丁酸甲酯主要由丁酸与甲醇在硫酸存在下酯化而得。因其带有宜人的香味和味道，也因此被用作食品和香水添加剂，例如苹果、香蕉、菠萝等果香型食用香精和威士忌酒香精，也可用于奶油香精的调香。

4、2-甲基-3-戊酮，分子式为c6h12o，熔点为-106℃，沸点118℃，常温下是无色或浅黄色可燃液体，中等毒性，微溶于水，易溶于乙醇、苯，可混溶于丙酮和乙醚。溶于氯仿。主要用作染料中间体，并可在医药、农药、纺织、油漆、选矿等行业中用作溶剂，也用于塑料及有机合成。

5、第一方面，本发明提供一种标志物组合，包括丁酸甲酯和2-甲基-3-戊酮。

6、目前，正常蜂蜜样品中不会被检出丁酸甲酯，而本发明发现该物质在zygosaccharomyces rouxii，zygosaccharomyces mellis strain ml534，zygosaccharomyces sp.nbrc，zygosaccharomyces sp.41sl-2015partial和zygosaccharomyces mellis partial等结合酵母属污染蜂蜜后，不同蜂蜜种类样品，不同污染浓度中均可稳定检出该物质。同时，关于蜂蜜中另一种常见微生物污染(芽孢杆菌)，尚未有研究在受到芽孢杆菌污染的蜂蜜中检出丁酸甲酯。

7、第二方面，本发明提供丁酸甲酯在作为检测蜂蜜中耐高渗酵母的标志物中的应用。

8、本发明进一步提供2-甲基-3-戊酮在作为检测蜂蜜中耐高渗酵母的标志物中的应用。

9、本发明进一步提供所述标志物组合在检测蜂蜜中耐高渗酵母中的应用。

10、第三方面，本发明提供一种检测蜂蜜中耐高渗酵母的方法，包括：通过检测蜂蜜中的丁酸甲酯和/或2-甲基-3-戊酮判断蜂蜜中是否存在耐高渗酵母。

11、进一步地，所述检测包括采用：质谱法、气相色谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法或气相色谱-质谱联用法进行检测。

12、进一步地，所述气相色谱-质谱联用法中气相色谱包括如下条件：

13、平衡温度40～50℃，时间10～20min；萃取温度40～50℃，时间25～35min；解吸温度为240～260℃，时间5～15min。

14、进一步地，所述气相色谱-质谱联用法中质谱法包括如下条件：

15、升温方式为：40～50℃保持1～2min，以2.5～3.5℃/min上升至220～230℃，以18～22℃/min上升至240～250℃，保持5～10min。

16、作为一种优选的具体实施方式，所述气相色谱-质谱联用法中气相色谱包括如下条件：

17、平衡温度40～50℃，时间为10～20min；样品穿刺深度25～35mm，速度15～25mm/s；萃取温度为40～50℃，萃取时间为25～35℃；搅拌速度为500～700rpm；解吸温度为240～280℃，时间为8～15min；萃取柱老化温度为160～200℃，时间为4～10min。

18、所述气相色谱-质谱联用法中质谱法包括如下条件：

19、升温方式为：40～50℃保持1～2min，以2.5～3.5℃/min上升至220～230℃，以18～22℃/min上升至240～250℃，保持5～10min；进样口温度为230～270℃，柱箱温度为40～50℃。电子离子源温度为220～260℃，电子能量为60～80ev，四极杆检测温度为130～170℃，溶剂延迟2～5min，质量扫描范围50-350。

20、进一步地，所述判断蜂蜜中是否存在耐高渗酵母包括：当丁酸甲酯和/或2-甲基-3-戊酮中的任一在匹配度高于预设匹配值的条件下检出，则判断所述蜂蜜被耐高渗酵母污染。

21、进一步地，所述预设匹配值可以根据实际情况确定，例如采用c6-c40正烷烃标准品作为碳标，根据样品测定程序对碳标化合物进行gc-ms分析，根据分离化合物色谱峰保留时间计算目标化合物的实际lri指数，对定性物质进行校正；结合匹配度>700的情况下有检出则认为蜂蜜中包含丁酸甲酯和/或2-甲基-3-戊酮。

22、进一步地，所述丁酸甲酯的定量离子m/z＝102.13，保留时间3.40min；所述保留时间的偏差不超过0.5min；

23、进一步地，所述2-甲基-3-戊酮的定量离子m/z＝100.16，保留时间3.83min；所述保留时间的偏差不超过0.5min。

24、本发明具备如下有益效果：

25、本发明研究得到了蜂蜜中耐高渗酵母的两个标志物，丁酸甲酯和2-甲基-3-戊酮。一方面拓宽了这两种物质的应用范围，另一方面还提供了基于这两种物质检测蜂蜜中耐高渗酵母的方法，在蜂蜜质量检测领域具有重要意义。

技术特征：

1.一种标志物组合，其特征在于，包括丁酸甲酯和2-甲基-3-戊酮。

2.丁酸甲酯在作为检测蜂蜜中耐高渗接合酵母属的标志物中的应用。

3.2-甲基-3-戊酮在作为检测蜂蜜中耐高渗接合酵母属的标志物中的应用。

4.权利要求1所述的标志物组合在检测蜂蜜中耐高渗接合酵母属中的应用。

5.一种检测蜂蜜中耐高渗接合酵母属的方法，其特征在于，包括：通过检测蜂蜜中的丁酸甲酯和/或2-甲基-3-戊酮，判断蜂蜜中是否存在耐高渗接合酵母属。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检测包括采用：质谱法、气相色谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法或气相色谱-质谱联用法进行检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述气相色谱-质谱联用法中气相色谱包括如下条件：

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述气相色谱-质谱联用法中质谱法包括如下条件：

9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，所述判断蜂蜜中是否存在耐高渗接合酵母属包括：当丁酸甲酯和/或2-甲基-3-戊酮中的任一在匹配度高于预设匹配值的条件下检出，则判断所述蜂蜜被耐高渗接合酵母属污染。

10.根据权利要求5-9任一项所述的方法，其特征在于；

技术总结
本发明涉及食品质量检测技术领域，尤其涉及一种检测蜂蜜中耐高渗接合酵母属的标志物和方法。所述标志物包括丁酸甲酯和2‑甲基‑3‑戊酮。所述方法包括：通过检测蜂蜜中的丁酸甲酯和/或2‑甲基‑3‑戊酮判断蜂蜜中是否存在耐高渗接合酵母属。本发明研究发现了能够用于检测蜂蜜中耐高渗接合酵母属污染的标志物，通过对这两种标志物进行定性或定量检测，可以有效检出蜂蜜中的耐高渗接合酵母属污染，并且鉴别效率高，重现性好，便于操作和推广，这对于蜂蜜产品的质量控制有重要意义。

技术研发人员：王银,程妮,赵浩安,曹炜
受保护的技术使用者：西北大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15