一种荧光免疫层析试纸条、定量分析方法与流程

本发明涉及一种荧光免疫层析试纸条、定量分析方法，属于生物免疫检测分析领域。

背景技术：

1、荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于荧光垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。荧光免疫层析试纸条具备使用方便快速、成本低、应用范围广的特点，可适应多种检测条件，因此广泛用于临床检测。

2、目前，市面上的荧光免疫层析定量检测试纸条，可配合定量检测仪进行定量检测并读取结果。由于待测样本的复杂性及免疫反应过程受到层析过程样本流动性、样本基质影响、蛋白包被捕获差异、硝酸纤维素膜的均一性、毛细牵引左右差异等的影响，导致检测线(t线)的反应强度可能由于层析过程差异发生显著的变化，而质控线(c线)会跟检测线有相同的影响，因此质控线可对检测结果修正，故用t/c值以减少试纸条间的差距。检测试纸条上送检样本的浓度时，荧光免疫分析仪扫描采集t、c线波峰图，通过计算峰高或峰面积得到反应强度，将t/c信号值(检测线信号值与质控线信号值之比)与样本浓度值用纵坐标和横坐标关联起来，形成信号值与样本浓度值曲线关系图，以此根据所测得信号值计算样本浓度值。一般情况下，t/c信号值随着样本浓度的升高而升高，并在升高到一定程度后趋于不变。上样试纸条送检时，仪器首先检测出该试纸条的t/c信号值，再根据内部预设好的标准曲线，检测分析出与t/c信号值对应的样本浓度值，输出检测结果，完成检测。

3、通常情况下，检测线上标记物的量与被测样本浓度成一定比例，质控线上标记物的有无代表样本层析顺利与否，与被测样本浓度无关，c线信号值保持不变。由此可见，在c线信号值不变的情况下，样本浓度值随着t线信号值的升高而升高。而实验证明，随着送检样本浓度的不断升高，t线信号值的增长幅度趋于变小，因此，t/c信号值也变化不明显，仪器不能据此明确分析出信号值所对应的样本浓度值，定量检测范围受限，容易导致测试高端的检测值不准确。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种荧光免疫层析试纸条，以解决现有荧光免疫层析试纸条容易导致高端的检测值不准确的问题。

2、本发明还提供了一种基于上述荧光免疫层析试纸条的定量分析方法。

3、为了实现以上目的，本发明的荧光免疫层析试纸条所采用的技术方案是：

4、一种荧光免疫层析试纸条，包括底衬、样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，所述层析膜上设置有检测线和质控线，所述结合垫上包被有荧光颗粒标记的单克隆抗体、荧光颗粒标记的第一配合物；所述检测线上包被有抗体a，所述质控线上包被有第二配合物和抗体b，所述第一配合物与第二配合物能够特异性结合；所述荧光免疫层析试纸条用于检测与所述荧光颗粒标记的单克隆抗体对应的抗原，检测线上包被的抗体a为待测抗原的第一单克隆抗体；质控线上包被的抗体b为待测抗原的第二单克隆抗体和/或所述荧光颗粒标记的单克隆抗体的抗体；所述第一单克隆抗体以及第二单克隆抗体均与所述荧光颗粒标记的单克隆抗体通过不同的抗原决定簇与待测抗原结合。

5、本发明的荧光免疫层析试纸条，上样检测时，检测线上包被的抗体a和质控线上的包被的抗体b均能够与结合垫上的标记物特异性结合。质控线(c线)在包被第一配合物或第二配合物的同时，还包被抗体b。由于含有待测物的样本在流经结合垫时会形成荧光颗粒标记的抗原和抗体的复合物，该复合物不仅能够被检测线(t线)上包被的抗体a捕捉形成夹心复合物，也能够被质控线上包被的抗体b捕捉形成夹心复合物，这样在样本中的待测物的浓度超过一定范围，检测线信号达到饱和而难以继续上升，信号值不再增加时，无法被检测线包被的a抗体捕捉的荧光颗粒标记的抗原和抗体的复合物在质控线处被抗体b捕捉。由于质控线包被的第二配体捕捉第一配体，在检测线信号达到饱和前，质控线信号值不会因样本中待测物浓度升高而增加，但检测线信号达到饱和后，质控线包被的抗体b对荧光颗粒标记的抗原和抗体的复合物的捕捉会使质控线的信号增加。因而随着样本待测物浓度的增加，检测线和质控线的比值(t/c)先增后降，比值先增后降的拐点为荧光免疫层析试纸条的采用现有方法进行分析的检测上限。

6、本技术的荧光免疫层析试纸条，可以解决现有荧光免疫层析试纸条容易导致高端的检测值不准确的问题。可以理解的是，所述第一单克隆抗体与第二单克隆抗体可以相同，也可以不相同。

7、进一步地，所述层析膜为硝酸纤维素膜(nc膜)。所述衬底为pvc衬底。

8、进一步地，所述质控线上包被的抗体b与第二配合物的摩尔质量之比为0.5～1:1。结合垫上的荧光颗粒标记的单克隆抗体和荧光颗粒标记的第一配合物的摩尔质量之比为1:1。

9、进一步地，所述第一配合物、第二配合物中的一个是抗体，另一个是与该抗体对应的二抗，或者一个是生物素，另一个是链霉亲和素。更进一步地，所述第一配合物、第二配合物中的一个为igg抗体、另一个为抗igg抗体，例如第一配合物为igg抗体，第二配合物为抗igg抗体。所述第一配合物为兔igg抗体，则第二配合物为羊抗兔igg抗体；所述第一配合物为鼠igg抗体，则第二配合物为羊抗鼠igg抗体；第一配配合物为鸡igg抗体，则第二配合物为羊抗鸡igg抗体。

10、进一步地，所述荧光颗粒选自荧光乳胶微粒、时间分辨荧光微球、上转换荧光微球中的一种。例如所述时间分辨微球为eu-时间分辨荧光微球。eu-时间分辨荧光微球的stokes位移大(>150nm)且荧光寿命比本底物质荧光寿命高5～6个数量级，因此，测定时只要延缓测量时间，待本底物质的荧光充分衰减后再测定标记物的信号就可有效地消除各种非特异性荧光的干扰，获得很高的灵敏度。

11、进一步地，所述荧光颗粒的粒径为100～500nm。

12、进一步地，所述结合垫上包被的荧光颗粒标记的单克隆抗体为荧光颗粒标记的人绒毛促性腺激素(hcg)抗体、荧光颗粒标记的促黄体生成素(lh)抗体或荧光颗粒标记的促卵泡激素(fsh)抗体。

13、进一步地，结合垫上包被的荧光颗粒标记的单克隆抗体为荧光颗粒标记的促黄体生成素抗体；所述促黄体生成素抗体、检测线上包被的抗体a中的一个为lh-α单克隆抗体、另一个为lh-β单克隆抗体；质控线上包被的抗体b与检测线上包被的抗体a相同或质控线上包被的抗体b为所述荧光颗粒标记的促黄体生成素抗体的抗体。

14、上述的荧光免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

15、将荧光颗粒标记的单克隆抗体、第一配合物的混合溶液加到结合垫上，干燥；

16、分别将抗体a的溶液涂覆在层析膜的检测线上、将抗体b和第二配合物的混合溶液涂覆在层析膜的质控线上，干燥；

17、将样品垫、干燥后的结合垫、干燥后的层析膜、吸水垫和衬底组装成荧光免疫层析试纸条。

18、本发明的荧光免疫层析试纸条的制备方法，工艺简单，便于推广和应用。

19、进一步地，所述混合溶液中抗体b的浓度为1-2mg/ml，例如可以是1mg/ml、1.5mg/ml或2mg/ml。所述混合溶液在质控线上涂覆速度为0.15-0.2μl/cm，例如可以是0.15μl/cm、0.16μl/cm、0.17μl/cm、0.18μl/cm、0.19μl/cm或0.2μl/cm。

20、进一步地，所述抗体a溶液中抗体a的浓度为0.18-1.8mg/ml，优选为0.2-1.8mg/ml，例如可以为0.18mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml或1.8mg/ml。所述抗体a溶液在检测线上的涂覆速度为0.15-0.25μl/cm，优选为0.15-0.2μl/cm，例如可以是0.15μl/cm、0.16μl/cm、0.17μl/cm、0.18μl/cm、0.19μl/cm、0.2μl/cm或0.25μl/cm。

21、本发明的基于荧光免疫层析试纸条的分析方法所采用的技术方案为：

22、本发明的基于上述荧光免疫层析试纸条的定量分析方法，包括以下步骤：

23、利用所述荧光免疫层析试纸条对待测样本进行加样检测，反应结束后将所得的检测线荧光信号值与荧光免疫层析试纸条的检测线荧光信号饱和值进行比较：若检测线荧光信号值＞检测线荧光信号饱和值，则根据t/c大于分界点时的标准曲线计算待测样本中待测物浓度；若检测线荧光信号值＜检测线荧光信号饱和值，则根据t/c小于分界点时的标准曲线计算待测样本中待测物浓度；若检测线荧光信号值＝检测线荧光信号饱和值，则根据t/c大于分界点时的标准曲线或t/c小于分界点时的标准曲线计算待测样本中待测物浓度；所述检测线荧光信号饱和值为所述荧光免疫层析试纸条的检测线上抗体a完全被特异性结合时的荧光信号值；

24、t/c大于分界点以及t/c小于分界点时采用的标准曲线的制定方法包括如下步骤：

25、配制一系列不同浓度的待测物标准溶液，利用所述荧光免疫层析试纸条对各待测物标准溶液进行加样检测，反应结束后记录各荧光免疫层析试纸条检测线和质控线上荧光信号值，计算各荧光免疫层析试纸条的检测线与质控线的荧光信号比值；将检测线的荧光信号值记录为t，将质控线的荧光信号值记录为c；

26、以所有待测物标准溶液对应的荧光免疫层析试纸条的检测线与质控线的荧光信号比值t/c的最大值为分界点，利用所有待测物标准溶液的浓度以及对应的荧光免疫层析试纸条的检测线与质控线的荧光信号比值t/c，以待测物标准溶液浓度值为自变量并以t/c为因变量进行分段线性拟合，即得。

27、本发明的基于上述免疫层析试纸条的定量分析方法，通过比较检测待测样品时得到的检测线荧光信号值与免疫层析试纸条的检测线荧光信号饱和值的大小，根据比较结果利用分段拟合得到的标准曲线计算待测样品的浓度，相较于利用其他免疫层析试纸条进行定量检测的方法，能够避免出现测试高端的检测值不准的问题。

28、检测线以及质控线的荧光信号值采用荧光免疫分析仪进行分析。通常情况下，为了进一步地提高检测的准确性，所述检测线荧光信号饱和值为利用荧光免疫层析试纸条在检测一系列不同浓度的待测物标准溶液时，t/c值大于分界点的待测物标准溶液的测得的检测线荧光信号值的平均值。可以理解的是，一系列不同浓度的待测物标准溶液中包括1个或2个以上t/c值＞所述分界点的待测物标准溶液且包括1个或2个以上t/c值＜所述分界点的待测物标准溶液，优选为2个以上t/c值＞所述分界点的待测物标准溶液且2个以上t/c值＜所述分界点的待测物标准溶液。

29、上述一系列不同浓度的待测物的标准溶液中，相邻浓度的标准溶液的待测物浓度相差0.5-10倍。一系列不同浓度待测物标准溶液包括5个以上不同浓度的待测物标准溶液。

30、采用本发明的荧光免疫层析试纸条进行加样检测的反应10-30min。