一种基于硅球双层量子点的免疫信号标签及呼吸道病毒四通道联合免疫层析检测方法

本发明涉及免疫层析检测，特别涉及一种基于硅球双层量子点的免疫信号标签及呼吸道病毒四通道联合免疫层析检测方法。

背景技术：

1、呼吸道病毒引起的急性呼吸道感染有广泛的传播范围和极高的死亡率，呼吸道传染病已成为全球性卫生问题，并在全球范围内造成重大经济损失。人类主要感染的呼吸道病毒有新冠病毒、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒等。患者感染急性呼吸道病毒的病症极其相似，这对医师指导临床治疗产生不利的效果，并且还影响了控制疫情发展。呼吸道病毒诊断和监测对于识别新毒株的出现、改进对潜在流行病和大流行的预测以及为疫苗战略提供信息至关重要。诊断数据有助于实时监测，可作为感染控制干预措施的基础，有利于遏制疫情发展，恢复社会发展秩序。

2、核酸检测是诊断呼吸道病毒感染的金标准，病毒分离培养、酶联免疫吸附测定等技术也是检测呼吸道病原体的经典方法，但这些技术耗时长，需要专业的操作人员和生物安全实验室，不适用于现场快速诊断。横向流动免疫层析检测技术，具有操作简便、检测时间短、使用场景灵活等优势，在新突发疫情的感染者大规模筛查中有巨大的应用潜力。目前市场上使用的胶体金法免疫层析试剂盒，存在检测通道少，检测靶标单一，灵敏度不足、无法定量等问题，对病原体精准筛查造成很大的误差，不利于感染者临床治疗和疫情防控。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明目的在于提供一种基于硅球双层量子点的免疫信号标签及呼吸道病毒四通道联合免疫层析检测方法，本发明提供的基于硅球双层量子点的免疫信号标签能够同时实现多种呼吸道病毒的快速准确高灵敏定量检测。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种基于硅球双层量子点的免疫信号标签，包括硅球双层量子点纳米颗粒和修饰在所述硅球双层量子点纳米颗粒表面的呼吸道病毒标记抗体；

4、所述硅球双层量子点纳米颗粒包括sio2纳米颗粒内核和包裹在所述内核表面的双层羧基化量子点外壳；每一层羧基化量子点外壳包括聚乙烯亚胺层和分布在所述聚乙烯亚胺层表面的羧基化量子点；

5、所述呼吸道病毒标记抗体包括抗腺病毒抗体、抗新冠病毒抗体、抗甲流病毒抗体或抗乙流病毒抗体。

6、优选的，所述sio2纳米颗粒内核的粒径为190～220nm；

7、所述硅球双层量子点纳米颗粒的粒径为230～260nm。

8、优选的，所述羧基化量子点为羧基化cdse/zns量子点，所述羧基化量子点的粒径为10～15nm。

9、本发明提供了上述基于硅球双层量子点的免疫信号标签的制备方法，包括以下步骤：

10、将sio2纳米颗粒与第一层聚乙烯亚胺溶液超声混合，得到sio2@pei纳米颗粒；

11、将所述sio2@pei纳米颗粒与第一层羧基化量子点溶液超声混合，得到sio2@qds纳米颗粒；

12、将所述sio2@qds纳米颗粒与第二层聚乙烯亚胺溶液超声混合，得到sio2@qds@pei纳米颗粒；

13、将所述sio2@qds@pei纳米颗粒与第二层羧基化量子点溶液超声混合，得到硅球双层量子点纳米颗粒；

14、将所述硅球双层量子点纳米颗粒与羧基活化剂混合，进行羧基活化，得到活化的硅球双层量子点纳米颗粒；

15、将所述活化的硅球双层量子点纳米颗粒与呼吸道病毒标记抗体混合，进行孵育，封闭未结合位点，得到基于硅球双层量子点的免疫信号标签。

16、本发明提供了上述硅球双层量子点的免疫信号标签在非诊断目的检测呼吸道病毒中的应用。

17、本发明提供了一种基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡，包括腺病毒检测试纸条、新冠检测试纸条、甲流检测试纸条和乙流检测试纸条；

18、每种试纸条包括样品垫、共轭垫、nc膜和吸收垫；所述共轭垫包被有上述基于硅球双层量子点的免疫信号标签，所述基于硅球双层量子点的免疫信号标签的呼吸道病毒标记抗体种类与试纸条检测病毒种类对应；

19、所述nc膜设有检测线和质控线，所述检测线包被有与试纸条检测病毒种类对应的病毒捕获抗体，所述质控线包被有山羊抗鼠igg抗体。

20、本发明提供了一种呼吸道病毒四通道联合检测免疫层析试剂盒，包括上述基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡和运行缓冲液。

21、优选的，以体积百分含量计，所述运行缓冲液包括8～12％吐温-20；8～12％胎牛血清；余量的pbs缓冲液，所述pbs缓冲液的浓度为10mm。

22、本发明提供了一种非诊断目的的呼吸道病毒四通道联合免疫层析检测方法，包括以下步骤：

23、将待测样品与运行缓冲液混合，得到待测液；

24、将所述待测液加至上述基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡的样品垫，静置后观察每种试纸条nc膜表面检测线的荧光条带，若荧光显色则待测样品含有该种病毒；

25、分别测试试纸条t线的荧光强度，根据所述荧光强度和预定的标准曲线获得待测样品中试纸条所对应病毒的含量；所述标准曲线为该种病毒含量与荧光强度的线性关系曲线。

26、优选的，所述静置的时间为10～20min。

27、本发明提供了一种基于硅球双层量子点的免疫信号标签，包括硅球双层量子点纳米颗粒(简写为sio2@dqds)和修饰在所述硅球双层量子点纳米颗粒表面的呼吸道病毒标记抗体；所述硅球双层量子点纳米颗粒包括sio2纳米颗粒内核和包裹在所述内核表面的双层羧基化量子点外壳；每一层羧基化量子点外壳包括聚乙烯亚胺层和分布在所述聚乙烯亚胺层表面的羧基化量子点；所述呼吸道病毒标记抗体包括抗腺病毒抗体、抗新冠病毒抗体、抗甲流病毒抗体或抗乙流病毒抗体。本发明采用量子点荧光免疫层析技术，以sio2纳米颗粒作为内核，以聚乙烯亚胺作为带强正电荷的夹层，通过静电吸附作用在外层包裹两层双层羧基化量子点外壳，硅球双层量子点富集了致密的量子点，具有优异的荧光性能和高敏感性，荧光信号可被采集用于定量检测，此结构在复杂样本中仍保持良好的稳定性和分散性，既提高了免疫信号标签的荧光性能，又为呼吸道病毒标记抗体提供了丰富的连接位点，可修饰多种呼吸道病毒标记抗体，为同时检测多种呼吸道病毒打下坚实基础。

28、本发明提供了上述基于硅球双层量子点的免疫信号标签的制备方法，此法操作简单，适合工业化批量生产。

29、本发明提供了一种基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡，包括腺病毒检测试纸条、新冠检测试纸条、甲流检测试纸条和乙流检测试纸条；每种试纸条包括样品垫、共轭垫、nc膜和吸收垫；所述共轭垫包被有上述基于硅球双层量子点的免疫信号标签，所述基于硅球双层量子点的免疫信号标签的呼吸道病毒标记抗体种类与试纸条检测病毒种类对应；所述nc膜设有检测线和质控线，所述检测线包被有与试纸条检测病毒种类对应的病毒捕获抗体，所述质控线包被有山羊抗鼠igg抗体。本发明在硅球双层量子点作信号标签的基础上，集成了多种免疫层析试纸条从而实行多通道联检，此免疫层析四联卡可以检测多种复杂真实样本，实现呼吸道病毒的高灵敏、高特异性四通道联合检测，扩大检测范围从而可快速筛查病毒类型，同时可精确定量病原浓度。同时，本发明提供的基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡制备方法简单、成本低，可实现批量生产。

30、本发明提供了一种非诊断目的的呼吸道病毒四通道联合免疫层析检测方法，此检测方法既可肉眼定性，亦可荧光定量，对免疫四联卡的工作环境和使用人员要求低。同时，本发明的检测方法灵敏度高、检测范围广、可一次性检测四种呼吸道病毒，在短时间内可快速筛查患者感染病毒类型，具有广阔的实际应用前景。实施例结果表明，本发明提供的检测方法对腺病毒、新冠n蛋白、甲流病毒和乙流病毒的可视化灵敏度分别为5×103pfu/ml、0.05ng/ml、5×103copies/ml和103copies/ml。根据各病毒的标准曲线方程，计算出腺病毒、新冠n蛋白、甲流病毒和乙流病毒检测线分别为575pfu/ml、9.7pg/ml、1479copies/ml和933copies/ml。