一种快速检测未分化、分化精原细胞钙信号的方法

本发明属于生殖医学，具体涉及一种快速检测未分化、分化精原细胞钙信号的方法。

背景技术：

1、钙信号是介导细胞信号传导的第二信使分子，广泛参与机体的多种生理与病理过程，与众多人类疾病的发生密切相关。现有研究表明，成熟精子中钙信号失衡是导致男性不育的一大重要因素，目前已知钙离子在精子运动、获能、超活化及受精中均起到重要作用。成熟精子由于是单一且易分离检测细胞，其钙信号的研究方法已经十分成熟，已经有各种商品化的钙信号检测荧光探针。然而钙信号在精子发生阶段的作用与机制研究十分匮乏，其异常是否导致不育也未见明确证据。

2、精子发生过程涉及多种细胞的形态分化，包括精原细胞的增殖与分化、精母细胞的减数分裂及精细胞的变形与精子成熟，上述任何过程的异常均可能导致雄性不育。精原细胞到精母细胞的发育过程中涉及到未分化精原细胞的增殖和精原细胞的分化，而精原细胞的增殖与分化调控机制尚未完全阐明。钙离子是否在精原细胞的增殖与分化过程中发挥重要有作用尚不明确，睾丸中细胞种类丰富，研究特定细胞类群中的钙信号通常需要将目标细胞分离出来，然后借助钙离子荧光探针进行检测，但是这一过程十分繁琐，且对细胞损伤较大，细胞容易死亡，严重影响了检测结果的准确性。离体的细胞在死亡过程中钙离子浓度会显著升高，导致最终检测到目标细胞的钙离子水平并不能真实反映其体内的情况。因此，目前急需发明一种快速、高效、简便的将分化以及未分化精原细胞分选开而后对其钙离子进行研究的方法，以便解析钙信号参与精原细胞增殖与分化的调控机制。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足与匮乏，本发明的目的是提供一种快速检测未分化、分化精原细胞钙信号的方法，适用于小鼠、人等精原细胞表面蛋白保守的哺乳动物。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种快速检测未分化、分化精原细胞钙信号的方法，包括以下步骤：

4、步骤1，睾丸细胞样本的处理：将分离干净的睾丸清洗后，扯碎睾丸组织，将其放入含有胶原酶ii和分散酶的hbss溶液中进行消化，之后加入胎牛血清终止消化，细胞筛过滤去掉细胞团，将得到的细胞悬液离心，去除上清后加入hbss溶液重悬，分别进行染色，包括indo-1am、c-kit-pe、thy-apc单独染色以及三种药物联合染色；

5、步骤2，流式细胞仪分析未分化、分化精原细胞：

6、a. 用流式细胞仪检测未染色样本，在fsc-a/ssc-a散图中找到睾丸细胞的主要群体画出p1门，在pe-a/apc-a散点图中标出不同细胞分布的象限得到p1-1；

7、b. 上机检测indo-1am、c-kit-pe、thy-apc单独染色以及三种药物联合染色的细胞样本，将a中圈门以及象限分布应用到三个单染样本以及三染样本得到p2、p3、p4、p5，在apc-a/pe-a散图中再次审查象限的正确性，得到p2-1、p3-1、p4-1、p5-1；

8、c. 流式细胞仪检测三联染色的睾丸细胞样本，应用以上圈门以及象限分布方法，采用步骤a和步骤b的参数调节电压找到细胞，根据未分化、未分化向分化转变、分化睾丸细胞thy-apc和c-kit-pe荧光信号的区别将样本分为三群；

9、d. 将p5-1中第一、二、三象限的三群细胞单独选出，在ssc-a和indo-1的蓝光散射面积下indo-1(blue)-a得到p6、p7、p8三个门，即为分出的未分化、未分化向分化转变、分化的三群细胞；

10、步骤5，应用软件，在三染管不同分区的细胞添加indo-1(blue)-a、indo-1(violet)-a的均值分析，通过indo-1(violet)-a与indo-1(blue)-a对应均值的比值得到各群细胞中的相对钙离子浓度。

11、进一步地，步骤1中，每颗成年睾丸采用3ml含有200-250 u/ml胶原酶ii和2u/ml分散酶的hbss溶液进行消化。

12、进一步地，步骤1中，消化条件为37℃、30min；胎牛血清的用量为消化液体积的10%。

13、进一步地，步骤1中，三种药物联合染色是先加入indo-1am染色，之后加入c-kit-pe和thy-apc染色。

14、与现有技术相比，本发明将双波长钙离子指示剂indo-1 am同精原细胞特异性表达蛋白的荧光直标抗体thy-apc、c-kit-pe联合使用以分选细胞，将钙离子在雄性生殖中的作用同细胞增殖与分化相联系，对日后研究钙离子对精子发生乃至雄性不育具有重要意义。

15、通过将钙离子指示剂与细胞表面marker相结合，本发明的分选方法可以更加简便、快速、高效的分选未分化、分化精原细胞并且检测细胞内相对钙浓度；具有新颖性，开创了钙离子在生殖领域的新应用。

技术特征：

1.一种快速检测未分化、分化精原细胞钙信号的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，每颗成年睾丸采用3ml含有200-250 u/ml胶原酶ii和2u/ml分散酶的hbss溶液进行消化。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，消化条件为37℃、30min；胎牛血清的用量为消化液体积的10%。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，三种药物联合染色是先加入indo-1am染色，之后加入c-kit-pe和thy-apc染色。

技术总结
本发明公开了一种快速检测未分化、分化精原细胞钙信号的方法。该方法使用温和酶解法制备睾丸单细胞悬液，利用indo‑1 AM、Thy‑APC、c‑kit‑PE、进行染色标记，基于睾丸细胞样本中细胞侧向散射光‑面积和前向散射光‑面积的差异确定所要分析的细胞群，然后利用Thy‑APC、c‑kit‑PE分别标记未分化精原细胞和分化后精原细胞，进一步选定特定细胞类群，最后检测每类特定细胞亚群中indo‑1 AM的荧光强度变化，从而得到未分化、未分化向分化转变及分化精原细胞中钙离子浓度的变化情况。采用该方法可以实现快速分析未分化、未分化向分化转变的及分化精原细胞的钙离子浓度，方法简单，便捷，为研究钙信号失衡导致的精原细胞功能异常鉴定了基础。

技术研发人员：曾旭辉,丁梦倩,张小宁,俞晶焱,陈晨
受保护的技术使用者：南通大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16