基于拉曼光谱的水稻白叶枯及水稻细菌性条斑病病原检测方法

本发明涉及水稻病原检测领域，具体涉及基于拉曼光谱的水稻白叶枯及水稻细菌性条斑病病原检测方法。

背景技术：

1、水稻白叶枯病是水稻主要细菌病害之一，最早于1884年在日本冈县发现，已在亚洲、非洲、美洲和澳大利亚等地发生，是许多国家重要的检疫对象。该病害在亚洲尤其在周年种植水稻的南亚和东南亚地区为害最为严重。在我国大部分地区也有发生，一般造成10％～30％的产量损失，严重可达50％以上。其病原为xanthomonas oryzae pv.oryzae(简称xoo)，是黄单胞菌属水稻黄单胞菌的致病变种，主要分布在维管束中，分离培养相对比较简单。

2、水稻细菌性条斑病也是水稻重要细菌病害，在亚洲广泛分布。该病害在我国部分地区发生严重，一般造成减产5％～10％，严重发病可减产20％以上。水稻细菌性条斑病的病原为xanthomonas oryzae pv.oryzicola(简称xoc)，也是黄单胞菌属水稻黄单胞菌的致病变种，分散在细胞组织间，分离起来比较困难，且容易出现杂菌，对在同一叶片上复合发生两种病害的组织更难分离到单一的菌株。

3、近年来研究调查发现，两病在同一稻田可以同时发生个别田块在同一叶片上出现两种病害的症状。因此单一的从水稻病株上检测出白叶枯病菌或是细菌性条斑病菌都存在一定的漏洞，不能完全符合现有的检疫要求，而且两病菌之间还存在不同程度的交互抑制作用(参见文献：1.黄瑞荣等.水稻细菌性条斑病与白叶枯病菌在稻叶上的相互作用研究.江西农业科技，1996，(4):33～34；2.王长方等.水稻细条病与白叶枯病菌间互作.福建农业学报，1999，14(增):40～44)。另外，这两种病菌在形态特征、生物学特性及病害流行因素等方面均存在诸多相似之处，在活体培养的情况下难以分辨。在农业生产上较难区分，对精准施药和检疫检验造成了一定的因难。

4、目前，主要应用的病原微生物检测方法包括表型鉴定法和分子遗传学两大类，通常能达到病原微生物的细胞组分、蛋白质、生理生化、形态、核酸等四个水平。表型鉴定法包含化学分类鉴定法，常规鉴定法以及数值分类鉴定法，能够对细胞组分、蛋白质、生理生化和形态这3个水平完成鉴定。核酸水平鉴定方法是分子遗传学鉴定法，主要针对质粒dna或病原菌染色体的检测，包括碱基含量测定、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)、核酸分子杂交、基因芯片、测序以及全基因组测序等。虽然这些方法都有各自独特的优点，但是检测过程不稳定、容易受外界条件干扰、检测步骤多、敏感程度底和消耗大量时间和人力都是应用中的缺点。

5、对于上述两种病原检测鉴定的主要依据包括症状特点、寄主范围、致病性、血清学反应、形态、培养和生理生化特性等。这些方法费时费力，且往往因样品带菌少、分离纯化过程复杂而失败，造成漏检及病菌扩散。因此，生产上迫切需要建立快速、简单、灵敏、准确的方法来鉴定这两种病菌。

6、近年来，拉曼光谱因其快速、无损、无惧水及微区分辨的特性，在微生物的检测中发挥了重要作用。每种细菌都有其特定的指纹图谱，因此拉曼光谱可用于细菌种类的快速鉴定。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本技术利用拉曼光谱因其快速、无损、无惧水及微区分辨，每种细菌都有其特定的指纹图谱的特性，在采用便携式拉曼光谱仪论证拉曼光谱进行区分具有可行性的基础上，利用共聚焦显微拉曼光谱仪，建立水稻叶片分离病原细菌xoc、xoo检测模型，以此开发快速的检测鉴定方法，为农业和检疫部门提供可选的技术支持和科学保障。

2、为此，本技术提出了一种灵敏专化、准确便捷的鉴定方法，利用共聚焦显微拉曼光谱仪，采集水稻叶片分离病原细菌xoc、xoo的拉曼光谱信息，实现了水稻细菌性条斑病病原和水稻白叶枯病病原的快速检测鉴定。

3、本技术首先通过便携式拉曼光谱仪，对两种病原菌的特征峰所代表的化学成分进行了总结及比较，发现引起这两种病害的病原菌的化学结构是不同的。然后，利用共聚焦拉曼光谱仪以及机器学习方法，探索两种水稻分离病原菌之间存在明显的差异，建立了基于拉曼光谱的两种水稻分离病原细菌的快速区分模型。

4、基于拉曼光谱的水稻白叶枯及水稻细菌性条斑病病原检测方法，包括以下步骤：

5、(1)制备检测样本：制备待测菌液；

6、(2)采集光谱：采用共聚焦显微拉曼光谱仪采集光谱；

7、(3)基于拉曼光谱，确定所述病原的种类，确定水稻感染的细菌性病害是水稻白叶枯还是水稻细菌性条斑病病原。

8、所述待测菌液的制备是剪取待测的发病叶段，将发病叶段的发病一端浸没在生理盐水中，得到待测菌液；优选地，将5-6片发病叶段的发病一端浸没在生理盐水中8-15min，得到待测菌液。

9、进一步地，所述待测菌液的制备是取待测发病水稻叶片分离病原菌后，在培养基中划线接种，置于恒温培养箱中培养，待培养基上长出单克隆菌落；将菌种放置在28℃恒温摇床中振荡孵育16-20h得到培养菌液，经离心和重悬步骤，并调整至1.0×107-9cfuml-1即得待测菌液。

10、作为优选，取出在-80℃条件下保存的菌种，无菌条件下在对应培养基中划线接种xoc、xoo，置于恒温培养箱中28℃分别过夜培养1d、2d。待培养基上长出单克隆菌落后，挑取菌落至装有5ml液体培养基的试管中，放置在28℃恒温摇床中振荡孵育16-20h培养至对数期，使菌种恢复活力。6000r·min-1离心10min，去上清，用10mmmgcl2将菌体配成悬浊液，将此步骤重复3次去除残留培养基；

11、共聚焦显微拉曼光谱仪检测体系中所需的菌液，则将xoc、xoo分别稀释至0.3×108cfu·ml-1，0.5×108cfu·ml-1用于接种。接种菌液需现配现用。

12、xoc接种方法：压渗法。选取生长良好的水稻叶片，作为待接种叶片。接种时，叶片背面朝上，用灭过菌的1ml注射器吸取之前准备好的菌液500μl，去掉针头，用合适的力度将菌液轻轻压入叶肉细胞间隙。接种过后的叶片会在压渗过的位置出现明显的水浸润圈。每株接2片叶子，接种完毕后盖膜，加湿器保湿。

13、xoo接种方法：剪叶法。选取生长良好的水稻叶片作为待接种叶片。将已灭菌的手术剪刀口沾取菌液，在距离叶尖1.0cm处垂直于主脉剪下叶尖，并用无菌棉签蘸取菌液轻轻压在伤口上4～6s，接种后盖膜，加湿器加湿。

14、所述待测菌液的制备是水稻叶片在接种2致病小种第5天时表现出相似的轻微症状，且在显微镜下可以观察到有细菌喷出。用75％酒精擦拭叶片，并用消毒剪刀剪下长1.5cm左右的发病叶段。在2ml离心管中加入200μl 0.9％生理盐水，将5-6片发病叶段的发病一端浸没在生理盐水中，使病原细菌向生理盐水持续喷出约10min，即可得到较高浓度的病原细菌悬浮液。

15、所述采集光谱，包括对拉曼光谱数据进行预处理和数据处理步骤。

16、所述预处理为首先将原始拉曼光谱转化为ascπ文件，用原始拉曼光谱减去背景溶液光谱后，使用savitzky-golay filtering算法对数据平滑降噪处理，再应用多项式拟合对光谱进行基线校正，最后用最大-最小标准化算法实现光谱数据的标准化，将得到的拉曼光谱使用z-score算法进行质量筛选，将筛选出的偏离光谱应用k-means聚类算法筛除宇宙射线，对其进行临近平均值“磨平”处理，完成质控，获得预处理的拉曼光谱；

17、所述数据处理步骤为：使用降维方式对数据进行可视化，具体是采用t-分布随机邻近嵌入t-sne、统一流行逼近与投影umap或主成分分析pca聚类方法。

18、进一步采用深度学习中的卷积神经网络cnn算法实现对水稻白叶枯及水稻细菌性条斑病病原的鉴定。

19、卷积神经网络是一种高效的识别算法，利用卷积核扫描图像并提取出图像的局部特征。取出一个与卷积核大小相同的区块，对区块的元素进行向量内积，乘积和就重新代表了特征图中的一个像素，一个卷积核可以提取图像的一个局部特征，采用多个卷积核用来充分地提取图像多个特征，“卷积”过程会产生大量的信息，如果直接训练分类器，计算量过大，特征维度过多，所以经过多个卷积层提取图像的信息后再进入池化层，池化层对区域特征的平均值或最大值进行聚合统计，具有降低数据维度的作用，进而简化训练数据输出分类结果。

20、鉴定水稻白叶枯及水稻细菌性条斑病病原的标准如下：

21、(1)cnn模型建立：通过微生物单细胞激光光镊拉曼光谱分析平台，分别采集xoc、xoo的拉曼光谱数据，建立cnn模型，对xoc和xoo进行分类；

22、(2)病原鉴定：对病原进行检测，根据cnn模型中不同权重的拉曼峰，判别病原菌的类型。

23、我们选取卷积神经网络用于病原菌单细胞拉曼光谱的鉴定。cnn是通过建立卷积层和池化层的前向传播，模拟人脑神经元传递的算法，通过卷积层高效提取光谱数据中的局部特征，池化层具有数据特征筛选作用，全连接层将拉曼光谱的特征信息映射到物种的标记空间。cnn模型在图片识别方面具有极大的优势，我们根据拉曼光谱数据特点构建1d的cnn模型，因此卷积神经网络能够提取每个物种的拉曼光谱的强度特征及其光谱曲率变化特征。

24、cnn模型在预测病原菌单细胞时通过被赋予不同权重的拉曼峰，实现xoc、xoo的识别。重要的拉曼谱带将在预测鉴定中发挥重要的作用。我们通过微生物单细胞激光光镊拉曼光谱分析平台采集到的xoc、xoo的拉曼光谱建立的cnn模型，来对xoc和xoo进行分类。因此，后续对xoc和xoo再次进行检测时，根据cnn模型的分类结果即可自动判别病原菌的类型。

25、本技术的有益效果：

26、水稻白叶枯和水稻细菌性条斑病在发病早期症状非常相似，无法进行区分，本技术首先利用便携式拉曼光谱仪，对两种病原菌的特征峰所代表的化学成分进行了总结及比较，发现引起这两种病害的病原菌的化学结构是不同的，据此可以对两种病原细菌进行区分。即，验证了采用便携式拉曼光谱仪可以对两种病原菌进行检测，这是迈出具有实际应用价值的一步，为后续实现田间即时检测奠定了基础。

27、在此基础上，利用共聚焦拉曼光谱仪以及机器学习方法，探索了两种病原菌之间存在明显的差异，建立了基于拉曼光谱的两种病原细菌的快速区分模型。通过拉曼光谱结合卷积神经网络算法(cnn)对两种病原菌的特定“指纹”进行分析，给予两种病原菌不同的标签，模型通过对拉曼光谱的比较分析实现对两种病原菌的分类鉴定，成功将两种病原菌进行区分。前期实验证明，模型准确率达100％，该模型效果相对较好，不逊色于其他病原检测效果。