一种基于妊娠期孕妇晚睡发生铁代谢异常的血浆脂肪酸代谢谱分析方法与流程

本发明涉及生物信息，具体涉及一种基于妊娠期孕妇晚睡发生铁代谢异常的血浆脂肪酸代谢谱分析方法。

背景技术：

1、晚睡，定义为在晚上11点后入睡，属于昼夜节律紊乱。缺铁与人类的睡眠-觉醒周期有关，在铁缺乏症的体外和体内模型均证实，昼夜节律对铁代谢至关重要。由于，妊娠期间的典型特征是总睡眠时间增加和白天嗜睡，从而影响晚上入睡时间延迟。同时，在怀孕期间，铁的生理需求大幅增加以支持胎儿、胎盘发育和母体对怀孕的适应。故妊娠期间铁缺乏症的发生率很高，该比率接近80％。缺铁或铁代谢异常与多种不良妊娠结局相关，例如孕产妇疾病增加、早产和胎儿宫内生长受限等。

2、妊娠期孕妇晚睡发生铁代谢异常的脂肪酸代谢异常概率极高。代谢组学是一种高灵敏度，高通量分析方法，可用于研究病理生理状态下低分子量代谢物的特征变化。脂肪酸组学是代谢组学的一个重要分支，旨在详细分析脂肪酸物种及其在生物体系中的多重作用。超高效气相色谱一质谱(gc/ms)联用技术作为脂肪酸代谢谱分析中广泛采用的技术之一，具有高分离度、高速度和高灵敏度的特点。

3、本方法基于妊娠期孕妇晚睡出现铁代谢异常的血浆脂肪酸代谢组学分析方法，包括收集病例和对照组患者的匹兹堡国际睡眠质量量表与血浆样本，量表评分进行标准化，血浆处理后经色谱柱分离，并采用质谱检测分析，再进行gc/ms检测分析后提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据。对数据进行分析得到代谢组轮廓，建立双重交叉验证筛选模型，筛选妊娠期孕妇晚睡出现铁代谢异常的的脂肪酸差异特异性标记物。本发明可以综合地体现妊娠期孕妇晚睡出现铁代谢异常情况时脂肪酸代谢产物的变异状况，可用于妊娠期孕妇晚睡是否出现铁代谢异常的早期预测和预后提供有利的技术支持。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基于妊娠期孕妇晚睡发生铁代谢异常的血浆脂肪酸代谢谱分析方法，解决了以上所述的技术问题。

2、本发明解决上述技术问题的方案如下：

3、一种基于妊娠期孕妇晚睡发生铁代谢异常的血浆脂肪酸代谢谱分析方法，包括以下步骤：

4、s1、样品制备收集妊娠期孕妇晚睡及对照组的血浆样本，经处理后准备进行超高效气相色谱-质谱检测分析，晚睡根据匹兹堡睡眠质量指数量表中第一项问题确定；

5、s2、超高效气相色谱-质谱检测分析：将血浆样本经色谱柱分离，并采用质谱检测分析；

6、s3、数据分析提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据，通过对数据进行分析，获得两组之间的差异性代谢物，并对这些物质结合已有文献报道进行初步鉴定和验证。

7、本发明的有益效果是：

8、以往研究中，常采用交叉验证方法建立代谢物筛选模型，特点是将样本的代谢组数据分为两个部分，其中一部分用来建立模型，另一部分用来评价模型的预测能力，根据预测能力的好坏选择模型参数，从而确定最终模型。但是这种建模方法存在一定缺陷：判别模型预测能力的不是独立样本。因为在建模过程中所有样本都会被用来建立模型，所以该过程存在一定程度的非独立性，干扰了模型预测能力的判别和模型预测误差的估计。缺乏完全独立性的建模科导致过拟合的可能，这样的模型不能真实有效地反映代谢组数据的信息，从而对标记物的筛选出现偏差。

9、本发明抽取交叉验证的优异特点，采用正交偏最小二乘判别分析(opls-da)和独立样本t检验对数据分析结果进行交叉比对，避免交叉验证方法非独立性的缺点，将其应用于独立脂肪酸分子浓度及脂肪酸联合作用治疗对铁代谢异常有较大改善作用的脂质代谢标记物的研究中，通过与患者铁蛋白、转铁蛋白浓度和生化指标(alt、ast、生物信息t、tc、tg、ldl)的相关分析确认并验证差异独立脂肪酸分子浓度及脂肪酸联合作用，从而在全面、综合地考察独立脂肪酸分子浓度及脂肪酸联合作用治疗对铁代谢异常有较大改善作用的脂肪酸相关标记物的同时，实现标记物的合理筛选。本方法对使用独立脂肪酸分子浓度及脂肪酸联合作用治疗妊娠期晚睡孕妇改善铁代谢综合征的早期预测和预后提供有利的技术支持。

10、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

11、进一步，s1中处理方法为：解冻样本，涡旋，取所有被试血浆200ul于15ml干燥螺口玻璃管中加入0.5ml甲苯，涡旋1min；向试样中加入10％乙酰氯甲醇溶液6ml，充氮气后，旋紧螺旋盖；振荡混合后于80℃士1℃水浴中放置2h，期间每隔20min取出振播1次，水浴后取出冷却至室温；将反应后的样液转移至15ml离心管中，分别用2ml碳酸钠溶液清洗玻璃管3次，合并碳酸钠溶液于15ml离心管中，混匀；13000r/min离心5min；取上清液作为试液，气相色谱仪测定。

12、进一步，s2中处理方法为：解冻样本，涡旋，取所有被试血浆200ul于15ml干燥螺口玻璃管中加入0.5ml甲苯，涡旋1min；向试样中加入10％乙酰氯甲醇溶液6ml，充氮气后，旋紧螺旋盖；振荡混合后于80℃士1℃水浴中放置2h，期间每隔20min取出振播1次，水浴后取出冷却至室温；将反应后的样液转移至15ml离心管中，分别用2ml碳酸钠溶液清洗玻璃管3次，合并碳酸钠溶液于15ml离心管中，混匀；13000r/min离心5min；取上清液作为试液，气相色谱仪测定；

13、质谱条件正离子模式条件以氮气作为雾化、锥孔气体飞行检测模型；正负极毛细管电压为3kv模式，两种模式下的锥形电压均为25v，源设置为120℃，锥形气体流量为50升/h，去溶剂化温度设定为450℃，850升/小时的去溶剂化气体流量；亮氨酸脑啡肽被用作锁定质量参考离子，m/z 556.2771正模式和负模式下m/z 554.2615，锁定喷雾以5μl/分钟的速率校准数据；使用两次斜碰撞能量扫描的连续模式获取mse数据；低能量模式，扫描范围50-2000da，扫描时间0.2s，碰撞能量设置为6v；高能量模式，扫描范围50-2000da，扫描时间0.2s，斜碰撞能量15-60伏。

14、进一步，s3中收集血浆样本，处理后经色谱柱分离，并采用质谱检测分析，在进行检测分析后提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据。采用正交偏最小二乘判别分析(opls-da)和独立样本t检验对数据进行分析，其中opls-da按照opls的vip值挖掘差异代谢物，得到两组有差异的独立脂肪酸分子浓度及脂肪酸联合作用，通过交叉比较，得到共有独立脂肪酸分子浓度及脂肪酸联合作用。再对共有独立脂肪酸分子浓度及脂肪酸联合作用与患者铁蛋白、转铁蛋白浓度和生化指标(alt、ast、生物信息t、tc、tg、ldl)做相关分析，通过分析相关性结果与临床症状的病理吻合性进行验证，得到代谢异常预测独立脂肪酸分子浓度及脂肪酸联合作用。

15、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。