基于AgNPs和ROP信号放大策略的OTA超灵敏电化学检测试剂盒及应用

本发明涉及基于agnps和rop信号放大策略的ota超灵敏电化学检测试剂盒及应用，属于生物分析。

背景技术：

1、赭曲霉毒素a(ota)是毒性最大的食源性真菌毒素之一，是已知的赭曲霉毒素中含量最高、分布最广、毒性最强的，被国际癌症研究机构定位为2b类致癌物质。ota广泛存在于农作物、饲料及多种药用植物中，具有肾脏毒性、肠道毒性、免疫抑制以及致癌致畸致突变等危害，可导致人类和动物的多种肾脏、肝脏和脑部疾病等。因此检测ota对提高产业质量和维护人类健康具有重要意义。

2、常用的ota检测技术，如高效液相色谱、液相色谱-质谱联用等，对ota的检测限普遍在ng/ml或μg/kg级别，对于样品中痕量水平的ota缺乏足够的灵敏性。而且这些方法普遍存在仪器设备昂贵，检测耗时长，需要专业的操作人员等缺陷。电化学生物传感技术因其具有响应迅速、仪器成本低、操作简单等优势在分析检测、生物医药等领域收到广泛关注。研究表明，生物传感的灵敏度取决于目标物浓度和输出信号强度之间的相关性。传统信号输出是将信号单元与目标物分子以1:1的方式结合，灵敏度较低，难以实现低丰度或痕量目标物的检测。因此，提高电化学传感的灵敏度，实现样品中痕量ota的快速检测具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的是提供基于agnps和rop信号放大策略的ota超灵敏电化学检测试剂盒及应用，该试剂盒具有选择性好、稳定性高、灵敏度高、绿色环保等优点。其原理是通过hdt将agnps修饰到电极上为适配体提供大量的反应位点，作为第一次信号放大手段。以nca-fc作为单体，引发rop反应，形成大量电活性聚合物，作为第二次信号放大。通过两次信号放大，可显著提高生物检测试剂盒的灵敏度。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：

3、基于agnps和rop信号放大策略的ota超灵敏电化学检测试剂盒，包括以下原料：金电极、aptamer、1,6己二硫醇、agnps、ota抗体-pei溶液、nca-fc单体、dmf、超纯水、liclo4。

4、进一步，部分原料使用时需配制成溶液，其中，aptamer溶液的浓度为1μm，1,6己二硫醇溶液的浓度为2mm，agnps溶液的浓度为20mg ml-1，nca-fc单体溶液的浓度为10mm；

5、aptamer的序列为5′-sh-(ch2)6-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggacacgccacccacaca-3’。

6、进一步，ota抗体-pei溶液的制备方法为：

7、①将edc溶液和nhs溶液等体积混合均匀；

8、②将ota抗体溶液和步骤①的溶液等体积混合，反应活化；

9、③在步骤②反应液中按照体积比3:1的比例加入pei溶液，反应，得到ota抗体-pei溶液。

10、进一步，edc溶液的浓度为200mm，nhs溶液的浓度为50mm，ota抗体溶液的浓度为6mg ml-1，pei溶液浓度为1mg ml-1；步骤②的活化温度为37℃，时间为1-3h；步骤③的反应温度为37℃，反应时间为1-3h。

11、进一步，nca-fc单体的制备方法为：

12、①称取3mmol二茂铁甲酸溶于60ml dcm中，0℃条件下滴加6mmol三乙胺，再加入3mmol hbtu和3mmol hobt，0℃反应1h后，旋转蒸干溶剂dcm，得到产物fc-obt；

13、②将1230μl tfa在0℃条件下滴入叔丁氧羰基-l-赖氨酸环内酸酐溶液中，0℃反应1h后，移入室温搅拌过夜，得到nca产物；

14、③将6mmol三乙胺在0℃条件下滴入所制备的3mmol fc-obt中，然后加入所制备的3mmol nca，室温反应，通过薄层色谱法监测反应过程，反应结束后，依次用饱和nahco3溶液、0.5m盐酸溶液、饱和nahco3溶液和超纯水洗涤，dcm有机相萃取，用无水na2so4干燥、过滤，真空干燥，得到单体nca-fc。

15、本发明的技术方案之一是：一种利用所述试剂盒检测ota的方法，包括以下步骤：

16、(1)将金电极浸泡在1,6己二硫醇溶液中，反应；

17、(2)将agnps溶液滴加到步骤(1)的电极上，反应；

18、(3)将aptamer溶液滴加到步骤(2)的电极上，反应；

19、(4)将待检测样品溶液滴加到步骤(3)的电极上，反应；

20、(5)将ota抗体-pei溶液滴加到步骤(4)的电极上，反应；

21、(6)将nca-fc单体溶液滴加到步骤(5)的电极上，反应；

22、(7)将步骤(6)的电极置于liclo4溶液中测量电化学信号。

23、进一步，步骤(1)-(5)反应后将金电极进行处理，处理方法为：将金电极用超纯水冲洗，氮气吹干；步骤(6)反应后将金电极进行处理，处理方法为：将金电极用dmf和超纯水冲洗，氮气吹干。

24、进一步，步骤(1)的反应温度为37℃，时间为1-3h；步骤(2)的反应温度为37℃，时间为0.5-1.5h；步骤(3)的反应温度为37℃，时间为0.5-1.5h；步骤(4)的反应温度为37℃，时间为0.5-1.5h；步骤(5)的反应温度为37℃，时间为0.5-1h；步骤(6)的反应条件为：真空，50℃反应0.5-1.5h。

25、本发明的技术方案之一是：一种所述试剂盒在制备检测ota试剂中的应用。

26、本发明检测方法流程图和rop原理图如图1所示。

27、有益效果

28、1、本发明基于agnps和rop信号放大策略大大提高了检测灵敏度。

29、2、本发明具有高效、环保、操作简便等优点，在生物分析检测领域具有广阔的应用前景。

30、3、本发明将开环聚合(rop)用于检测ota的试剂盒中。本发明通过au-s键将1,6己二硫醇(hdt)修饰到金电极上，然后加入agnps将其修饰到hdt上，接着将一端修饰巯基的适配体与agnps连接，然后加入赭曲霉素a(ota)使其与适配体结合，之后加入ota抗体-聚乙烯亚胺(ab*)，与ota特异性识别，聚乙烯亚胺上的氨基引发rop反应，形成大量电活性探针(二茂铁甲酸缩水甘油酯，nca-fc)标记的聚合物。

31、4、在最佳实验条件下，研究了该方法的检测灵敏度，发现电流强度与ota浓度的对数之间存在线性关系。线性范围为1pg/ml～1μg/ml，线性方程为i(μa)＝1.04969x+4.14494，r2为0.997，x＝lg cota，该方法的检测限(lod)为117fg/ml(s/n＝3)。试剂盒稳定性良好，在4℃下分别储存5、7、9、14天后，电极的峰值电流仍保持在初始值的99.46％、99.36％、98.50％、98.49％，说明本发明对ota的检测具有灵敏度高、稳定性好以及重现性好的特点，在实际样品的检测中具有很大的潜力。