抗DJ-1K182Hcy抗体的抗原肽及抗体与用途

本发明属于生物，具体涉及dj-1 k182hcy抗原肽及抗dj-1 k182hcy抗体与用途，用于帕金森病的发病机制研究和疾病早期诊断。

背景技术：

1、帕金森病(parkinson’s disease,pd)是仅次于阿尔茨海默病(alzheimerdisease,ad)的第二常见的神经退行性疾病[1]。其特征是患者黑质致密部多巴胺能神经元的丧失。氧化应激和线粒体功能障碍被认为是帕金森病神经退行性变的主要原因[2]。dj-1基因(park7)的功能缺失突变导致常染色体隐性遗传形式的帕金森病。dj-1具有多种功能，包括抗氧化应激、转录调控、伴侣、蛋白酶和线粒体调控[3]。dj-1还能激活多巴胺合成，调节多巴胺代谢和体内平衡[4]。高dj-1水平的细胞对氧化应激和pd相关神经毒素具有更强的防御能力，而dj-1功能障碍会加重pd的氧化应激[5，6]。因此，dj-1在pd的发病机制中参与重要的环节。

2、高水平的同型半胱氨酸(homocysteine,hcy)已被确定为帕金森病的危险因素之一[7]。在pd患者中，hcy水平与年龄、病程和疾病严重程度都呈正相关[8]。炎症、微血管损伤、自身免疫反应等多种潜在机制可以解释高同型半胱氨酸血症与帕金森病之间的生物学联系[9，10，11]，然而hcy在pd发病机制中的神经毒性的具体分子机制仍有待阐明。

3、同型半胱氨酸硫内酯(homocysteine thiolactone,htl)是一种由甲硫基trna合成酶(methionyl-trna synthetase,mars)催化的hcy活性硫酯[12]。据报道，htl与底物蛋白中的赖氨酸残基形成共价肽键，这是一种称为同型半胱氨酸化(homocysteinylation,khcy)的翻译后修饰[13]。该反应可以通过巯基自由基机制改变蛋白质结构和功能，引起蛋白质损伤，并导致自身免疫反应和血栓形成等多种病理后果[14]。例如：已证明pd相关蛋白α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)的同型半胱氨酸化会加重α-syn聚集、神经毒性和多巴胺能神经元变性[15]。

4、参考文献：

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技术实现思路

1、dj-1为同型半胱氨酸化的底物之一，本发明发现dj-1的同型半胱氨酸化主要发生于第182位赖氨酸残基(lysine 182,k182)，该位点的修饰减弱了dj-1抗氧化应激的活性。阻断dj-1在k182位点的同型半胱氨酸化可恢复其在体内和体外的神经保护功能。本发明进一步发现dj-1 k182hcy与pd的关系，pd模型小鼠脑内存在dj-1 k182hcy修饰，且dj-1k182hcy修饰程度随着年龄增加，dj-1 k182hcy可作为pd诊断的生物标志物，以及预防、缓解和/或治疗pd发展的靶点。检测实验动物标本及人体中的dj-1 k182hcy修饰程度对pd发病机制的理解与病情的评估具有重要的作用。但目前为止，尚无检测脑内dj-1 k182hcy的抗体，给相关研究带来了极大的不便。

2、本发明的目的在于针对现有技术无法特异性检测dj-1 k182hcy的问题，提供一种抗dj-1 k182hcy抗体的抗原肽，以及提供抗dj-1 k182hcy抗体的用途。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、一种dj-1 k182hcy修饰的抗原肽，其氨基酸序列为：aaqvk(hcy)aplv。

5、一种抗dj-1 k182hcy抗体，以上述抗原肽为抗原制备得到。

6、进一步地，所述的抗体以ac-[aaqvk(hcy)aplv]2k-a-cooh(ac-aaqvk(hcy)aplv-aaqvk(hcy)aplv-k-a-cooh)与载体蛋白交联后得到的交联多肽为抗原制备得到，所述的载体蛋白优选为klh。所述的抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体。

7、进一步地，所述的多克隆抗体为兔多克隆抗体。

8、进一步地，所述的兔多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：以上述交联多肽为免疫原免疫家兔，收集家兔血液制备抗血清，将抗血清分离纯化得到兔多克隆抗体。所述的抗血清的分离纯化采用常规技术手段进行，即采用抗原亲和层析法对所述抗血清进行纯化，以得到纯化的兔多克隆抗体。

9、本发明dj-1 k182hcy修饰的抗原肽具有很好的免疫原性，以其为免疫原得到的兔多克隆抗体特异性好、效价高，只识别dj-1 k182hcy，而不识别无khcy修饰的dj-1或dj-1其他位点khcy。基于所述抗体的特异性，其可用于检测人脑标本及动物标本中dj-1 k182hcy的修饰程度，用于pd发病机制的研究，以及用于pd的患病风险评估、早期诊断等。

10、一种检测dj-1 k182hcy修饰程度的试剂，包括上述抗体。

11、一种pd风险评估和早期诊断的试剂，包括上述抗体。

12、本发明的优点和有益效果：

13、(1)dj-1是同型半胱氨酸化的底物之一，通过质谱分析dj-1的khcy主要发生于k182。该位点的修饰减弱了dj-1抗氧化应激和线粒体功能障碍的活性，因此检测该位点的khcy具有重要的意义。目前尚无特异性识别dj-1 k182hcy的抗体，基于本发明抗原肽得到的特异性识别dj-1 k182hcy的抗体解决了这一问题。

14、(2)本发明的抗dj-1 k182hcy抗体能够用于pd的患病风险评估和早期诊断。