基于单色宽展结构光照明的光切片显微成像装置及方法

本发明属于显微成像，具体涉及一种基于单色宽展结构光照明的光切片显微成像装置及方法。

背景技术：

1、结构光照明显微(structured illumination microscopy，sim)技术是一种宽场超分辨光学显微成像技术，其利用不同方向、不同相移量的结构光照亮样品并依次记录生成的“莫尔条纹”，最后利用相应算法重构出样品的高频信息，获得样品的超分辨图像。sim具有光毒性低、成像速度快以及对荧光样品没有特殊要求等优点，从而在活体样品显微成像技术中脱颖而出。

2、sim具有超分辨成像和三维层析成像能力。例如，雷铭等人提出了一种基于数字微镜器件(dmd)投影的高速结构光照明光学显微系统及方法。通过记录样品在三个方向、三步相移结构光照明下的9幅原始结构光强度图像，可以获得超越衍射极限的样品图像。此外，通过记录相移量分别为0°、120°、240°的强度图像，可以计算出任一轴向位置z处的宽场层析图像。此外，将彩色成像与三维sim成像相结合，提出了一种基于希尔伯特变换的三维彩色sim显微成像方法。该方法对于每一个轴向位置只需要采集两幅原始图像，就能够重构出一个光切片图像，有效提高了三维彩色成像的速度和效率。浙江大学匡翠方等人提出了一种基于扫描振镜和dmd的多色sim超分辨显微成像方法，利用振镜快速切换不同的激光波长，并利用dmd产生条纹结构光，实现了多色三维超分辨sim显微成像。清华大学戴琼海院士团队提出在传统sim的成像光路中，通过在样品第一像面后加入中继透镜，并在频谱平面加入二维扫描振镜来扩大成像视场。

3、在目前主流光切片sim中，大都采用led照明和dmd/slm(空间光调制器)调制产生条纹结构光。dmd上的图案沿着结构光0级、±1级衍射光的方向被成像投影到样品，由于畸变的影响，成像系统对三个衍射光造成不同的相位调制时，成像视场内条纹对比度会出现下降。此外，由于dmd的色散效应，当采用led照明和dmd生成正弦条纹结构光时，照明光到达样品平面的光强利用率较低。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种基于单色宽展结构光照明的光切片显微成像装置及方法。本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：

2、本发明提供了一种基于单色宽展结构光照明的光切片显微成像装置，包括单色扩展照明产生模块、光束调制模块、成像模块和图像处理模块，其中，

3、所述单色扩展照明产生模块用于利用单频激光产生部分相干的、具有一定角度分布的单色扩展照明光；

4、所述光束调制模块用于对所述单色扩展照明光进行光调制，产生具有不同相移量的条纹结构光；

5、所述成像模块用于利用所述不同相移量的条纹结构光对样品厚度方向的不同轴向位置进行逐层成像，获得样品每个轴向位置的不同条纹结构光照明下的强度图像；

6、所述图像处理模块用于根据每一轴向位置的多幅强度图像获得当前轴向位置的光切片图像，并根据不同轴向位置的光切片图像重建样品的三维图像。

7、在本发明的一个实施例中，所述部分相干光产生模块包括激光器以及沿激光器的光轴方向依次设置的第一显微物镜、毛玻璃片和第一透镜，其中，

8、所述激光器用于发射单频激光；

9、所述第一显微物镜和所述第一透镜用于将所述激光器产生的单频激光进行扩束，以覆盖所述光束调制模块中的数字化投影器件；

10、所述毛玻璃片垂直于所述单频激光的光轴设置且所述毛玻璃片的轴心偏离光轴，所述毛玻璃片能够绕光轴旋转以产生动态散射的部分相干光；所述毛玻璃片与所述第一透镜的焦点之间的距离为7.5～15mm，以产生具有一定照明角度分布的扩展照明光。

11、在本发明的一个实施例中，所述光束调制模块包括沿光轴方向依次设置的数字化投影器件、第二透镜、频谱滤波器和第三透镜，其中，

12、所述数字化投影器件用于对来自所述部分相干光产生模块的单色扩展照明光进行光调制，产生具有不同相移量的条纹结构光；

13、所述第二透镜用于将所述条纹结构光聚焦在所述频谱滤波器上；

14、所述频谱滤波器用于对所述数字化投影器件调制后的条纹结构光进行频谱选择，仅允许±1衍射光的频谱通过；

15、所述第三透镜用于将经过所述频谱滤波器频谱选择的光束扩束准直成平行照明光。

16、在本发明的一个实施例中，所述数字化投影器件为数字微镜阵列或空间光调制器，用于加载二进制结构光条纹并依次进行0、2π/3、4π/3相移操作。

17、在本发明的一个实施例中，所述光束调制模块还包括倾斜设置在所述第一透镜与所述数字化投影器件之间的第一反射镜和第二反射镜，用于将来自所述第一透镜的单色扩展照明光反射至所述数字化投影器件的表面。

18、在本发明的一个实施例中，所述成像模块包括第三反射镜、二向色镜、第四透镜、第四反射镜、压电平移台、第二物镜、滤波片和相机，其中，

19、所述第三反射镜、所述二向色镜、所述第四透镜、所述第四反射镜、所述压电平移台和所述第二物镜沿光轴方向依次设置，样品设置在所述第二物镜远离所述压电平移台的一侧，所述压电平移台能够调节所述样品与所述第二物镜之间的轴向距离，使得来自所述第二物镜的条纹结构光聚焦在所述样品厚度方向的不同层上；

20、所述滤波片和所述相机依次设置在所述二向色镜远离所述第四透镜的一侧，用于接收从所述样品反射回的光束，并获得单层光切片图。

21、在本发明的一个实施例中，所述图像处理模块包括数据采集卡和计算机，其中，

22、所述数据采集卡电连接所述相机，用于传输所述相机记录的不同条纹结构光照明下的强度图像，并发送至所述计算机；

23、所述计算机用于根据样品对应厚度位置的多幅强度图获得当前厚度位置的光切片图像，并根据不同厚度位置的光切片图像重建样品的三维图像。

24、本发明的另一方面提供了一种基于单色宽展结构光照明的光切片显微成像方法，包括：

25、s1：利用上述实施例中任一项所述的基于结构光照明的光切片显微成像装置获得样品的多个结构光照明下的强度图像；

26、s2：利用所述多个结构光照明下的原始强度图像获得样品的一个光切片图像；

27、s3：通过沿着轴向方向移动样品或物镜并重复获得样品在不同厚度位置的多个单层光切片图，获得不同厚度位置的平面图像，组成样品的三维图像。

28、在本发明的一个实施例中，所述s2包括：

29、获取样品在当前厚度位置的三个单层光切片图：

30、dm(x,y)＝din(x,y)·{1+cos[2πkx+2(m-1)π/3]}+dout(x,y)，

31、其中，din(x,y)表示单层光切片图的在焦成分，dout(x,y)表示单层光切片图的离焦成分，m表示相移次数，k为条纹的空间频率；

32、令m＝1、2、3组成方程组，根据所述方程组求解在焦成分din(x,y)：

33、

34、对在焦成分din(x,y)进行去卷积运算，获得样品在当前厚度位置处的平面图像：

35、

36、其中，表示在焦成分din(x,y)的傅里叶频谱，表示光学传递函数，表示二维逆傅里叶变换，为频率域的切趾函数，w是维纳系数。

37、与现有技术相比，本发明的有益效果有：

38、1、本发明的照明光采用单频激光通过旋转毛玻璃去相干来产生，克服了dmd对宽带照明光的色散效应；通过调节毛玻璃片与照明光焦点之间的轴向位置，可以改变照明的等效发光点直径和空间相干性，减小sim的光切片厚度(提高轴向切片精度)。随着毛玻璃片与照明光焦点之间的距离增加，条纹对比度呈下降趋势，而切片精度(可分辨的轴向距离)呈上升趋势。当两者距离为7.5-15mm(有效散射光斑直径为2mm)时，可以兼顾高的条纹对比度和切片精度(如图4所示)。

39、2、本发明通过在数字化投影器件(数字微镜阵列或空间光调制器)加载二进制结构光条纹，并通过对照明光的频谱进行滤波(遮挡0级光频谱，仅让±1衍射光的频谱通过)，可在整个成像视场内产生高对比度的条纹结构光。该方法在dmd上加载的条纹周期是传统方法的两倍，可以用更多像素(比传统直接条纹投影的方法多出一倍)来产生相同周期的条纹结构光，更有利于完成条纹的采用和相移操作。

40、3、本发明提出的基于单色宽展结构光照明的光切片显微成像装置，可以应用于不同的倒置显微镜。该装置通过将光路中的第三反射镜更换为二向色镜，将整个照明和荧光成像单元全部收纳到显微镜机身后方，对显微镜机身要求最低；当将第三反射镜更换为二向色镜后，还可以和显微镜机身其他成像组成双模式模式(例如荧光/相位)成像。

41、以下将结合附图及实施例对本发明做进一步详细说明。