一种单分子均相发光检测系统及检测方法

本发明涉及蛋白检测，具体涉及一种单分子均相发光检测系统及检测方法。

背景技术：

1、感染性疾病、癌症、心肌梗死以及阿尔兹海默病等疾病早期的靶标蛋白丰度过低，传统酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)只能提供皮摩水平(10-12m)的检测限，难以满足这些疾病早期诊断的需求，同时也限制了更多蛋白检测标志物的发掘与运用。为了进一步提高蛋白检测的灵敏度以提高对疾病进展和转归的理解，近年来，基于单分子检测的技术平台被开发用于蛋白的超灵敏检测。

2、例如，数字elisa(digital elisa,delisa)技术是近些年发展的单分子蛋白检测技术，其原理类似于数字聚合酶链反应技术(digital polymerase chain reaction，dpcr)。single moleculearrays(simoas)是当前超灵敏蛋白检测的金标准方法。simoas是一个基于微孔阵列的delisa技术，该方法通过使用远多于靶标物质数量的包被有捕获抗体的磁珠实现珠子结合单个靶标分子或不结合靶标分子的目的。被珠子捕获了的单个蛋白分子进一步与生物素标记的检测抗体以及链霉亲和素连接的酶结合形成三明治夹心复合物,形成的免疫复合物与酶底物混合后被分离到只能装载一个珠子大小的孔中。将微孔阵列进行油封处理后，载有单个酶标记的免疫复合物会产生高浓度的荧光产物并局限在约50飞升的孔中。通过对微孔阵列进行荧光成像区分阳性微孔(结合单个酶分子的珠子)和阴性微孔，计数同时含有珠子和荧光产物的孔数相对于含有珠子的孔的总数确定测试样品中的蛋白质浓度。

3、但是，simoas技术对飞升大小的微孔阵列芯片的加工精度要求高，操作流程较为繁琐。

4、smcxpro免疫平台将传统elisa检测流程和单分子计数(single moleculecounting，smc)技术结合用于单分子检测。先基于传统elisa操作流程形成夹心复合物，即用微孔板或珠子捕获样本中的蛋白分子，再与标记有荧光分子的检测抗体结合形成夹心复合物。smc技术的专有洗脱步骤将荧光标记的检测抗体从上述夹心复合物中解离出来，随后，将洗脱液转移到384孔板。再将384孔板放入smcxpro仪器中，当激光通过狭窄的检测窗口时，激光会激发荧光标记的检测抗体，光电二极管捕获单个光子并记录信号完成单个分子的数字定量。

5、但是，该技术检测通量有限；对检测荧光信号的光学系统要求高；检测流程并不是完全自动化，即便与其他模块结合实现自动化操作，但同时也增加了实验成本。

6、基于此，本发明设计了一种单分子均相发光检测系统及检测方法以解决上述问题。

技术实现思路

1、针对现有技术所存在的上述缺点，本发明提供了一种单分子均相发光检测系统及检测方法。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

3、一种单分子均相发光检测系统，包括：

4、聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片；

5、磁控操作平台；

6、长余辉检测探针；

7、以及旋转磁场、梯度磁场、震荡分散磁场和集群离散磁场。

8、本发明还公开了一种单分子均相发光检测方法，包括以下步骤：

9、一、制备聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片；

10、二、搭建磁控操作平台；

11、三、制备长余辉检测探针；

12、四、磁场辅助均相发光的单分子检测芯片检测肌钙蛋白，包括以下步骤：

13、(1)将待测样本与偶联了抗肌钙蛋白抗体的磁珠混合，并加入聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片的孵育池中；

14、(2)施加旋转磁场以增强肌钙蛋白与磁珠的结合，随后向孵育池中加入长余辉检测探针，在旋转磁场作用下进一步促进夹心免疫复合物的接触和形成；

15、(3)施加梯度磁场操控磁珠从孵育池穿梭到聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片的清洗池，随后通过施加震荡分散磁场去除非特异性结合的分子；

16、(4)施加梯度磁场操控磁珠从清洗池穿梭到聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片的检测池，在集群离散磁场作用下实现夹心免疫复合物的空间均匀分布；长余辉检测探针的长余辉材料受到激发后，在规定时间进行余晖定量，从而实现肌钙蛋白的单分子检测。

17、更进一步的，步骤一、制备聚二甲基硅氧烷单分子检测芯片，具体包括以下步骤：

18、(1)基底准备：把硅烷化处理后的硅片浸在剥离溶液中，将硅片转移到去离子水中清洗；把硅片放到旋转漂洗烘干机中干燥，随后将硅片完全干燥；

19、(2)光刻胶的旋涂和软烘：把硅片放到匀胶机中，将光刻胶倒在硅片中心，在硅片上旋涂光刻胶；将旋涂了光刻胶的硅片软烘；

20、(3)光刻胶的曝光和后烘：在硅片上添加掩膜，使用紫外光对光刻胶进行曝光处理；曝光处理后，将硅片烘焙；

21、(4)显影、漂洗以及干燥：将硅片放在显影液中，用异丙醇喷洗显影硅片后，使用氮气吹干硅片；得到含有孵育池、清洗池和检测池设计的模具；

22、(5)在基板上铸造pdms复刻物：将pdms预聚物和固化剂混合，并充分搅拌，真空排气，然后倒在模具上，再次排气，烘焙；将pdms复刻物从模具上剥离，切割pdms复刻物，并在上面进行打孔；

23、(6)pdms复刻物与玻璃的键合：用压敏胶清洁pdms，用氧等离子体处理pdms和玻璃表面；将pdms和玻璃表面键合形成密闭的pdms微流控设备；在模具的孵育池、清洗池以及检测池之间填充油相，物理隔离三个区域。

24、更进一步的，步骤一中，(2)光刻胶的旋涂和软烘：把硅片放到匀胶机中，将光刻胶倒在硅片中心，在硅片上旋涂光刻胶；将旋涂了光刻胶的硅片分别在65℃和95℃条件下软烘3min和9min。

25、更进一步的，步骤一中，(3)光刻胶的曝光和后烘：在硅片上添加掩膜，使用紫外光对光刻胶进行曝光处理；曝光处理后，将硅片分别在65℃和95℃条件下烘焙2min和7min；

26、更进一步的，步骤一中，(5)在基板上铸造pdms复刻物：将pdms预聚物和固化剂以10：1的质量比混合，并充分搅拌，真空排气40min，然后倒在模具上，再次排气，置于65℃下烘焙4小时；将pdms复刻物从模具上剥离，切割pdms复刻物，并在上面进行打孔。

27、更进一步的，步骤二、搭建磁控操作平台，具体包括以下步骤：结合电源模组、信号发生器、功率放大器与三轴亥姆赫兹线圈组，搭建工作区间可调且磁场强度均匀的磁控平台。

28、更进一步的，步骤三、制备长余辉检测探针，具体包括以下步骤：

29、(1)将长余辉材料、表面活性剂以及羧甲基纤维素混合；

30、(2)向上步所得物中加入水与四氢呋喃的混合溶液，超声细胞粉碎机超声处理；

31、(3)将得到的溶液反复清洗后重悬于适量的去离子水中，再次使用细胞破碎仪超声处理；

32、(4)取一定量的上述溶液并向其中加入适量的4-吗啉乙磺酸溶液，4℃条件下离心，弃去上清液加入mes溶液，超声细胞粉碎机超声处理；

33、(5)向上步所得物中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺溶液混合，离心并弃去上清液；

34、(6)向上步所得物中加入磷酸盐缓冲液，超声细胞粉碎机超声处理；

35、(7)向上步所得物中加入待连接的抗体，放于混匀仪器上混合，接着离心，倒去上清液后，向其中加入pbs溶液，超声细胞粉碎机超声处理，再加入牛血清白蛋白，混匀仪器上混合；

36、(8)混合结束后，将上步所得物离心后弃去上清液，加入牛血清白蛋白，超声细胞粉碎机超声处理，即得长余辉检测探针。

37、更进一步的，步骤三中，(7)向上步所得物中加入待连接的抗体，放于混匀仪器上混合2小时，接着在4℃条件下离心，倒去上清液后，向其中加入pbs溶液，超声细胞粉碎机超声处理，再加入含有10％的牛血清白蛋白，混匀仪器上混合1小时。

38、有益效果

39、本发明的聚二甲基硅氧烷(pdms)单分子检测芯片在磁场辅助下可以精准可控地完成以磁珠为载体的免疫复合物的操控，使得操作过程更为简化，长余辉探针的使用可以屏蔽非特异性信号的干扰，减少样本基质对检测的干扰，进一步保证了单分子检测的信噪比；此外，集群离散磁场的使用可以将夹心免疫复合物在检测池中实现空间均匀分布，保证了大多数的“免疫复合物个体”可以被有效分析；

40、本发明的聚二甲基硅氧烷(pdms)单分子检测芯片成本低廉且加工简单，在磁场精准可控的驱动下能够保证大多数的“免疫复合物个体”被有效分析，解决了单分子检测“阳性事件”和“总事件”检测率有限或芯片加工难度高的问题；本发明涉及的单分子检测技术无需复杂的光学检测系统，也无需高难度的芯片加工工艺，使得单分子检测成本可控；

41、本发明通过磁场控制磁珠在不同区域内进行穿梭提高了单分子检测流程的自动化程度，从而简化了实验操作，尤其是集群离散磁场的施加有助于大多数的“免疫复合物个体”被有效分析，从而有助于反应灵敏度的提高；还可以使用目前成熟的软件进行预先编程，在规定时间改变磁场强度和类型，使单分子检测流程更加自动化；

42、本发明长余辉探针的使用以及磁场精准操控磁珠在不同区域穿梭的联合应用减少了非特异性背景的干扰，从而提高了检测的信噪比；

43、本发明使用的长余辉材料，其具有延迟发光的特点，能规避非特异性信号对检测信号的干扰，且材料本身斯托克斯位移大，其发射光不受激发光的干扰，故本发明涉及的单分子检测对光路检测系统要求不高；

44、本发明通过改变磁场的输入参数，从而能够改变磁场对磁珠集群行为的影响，使磁珠的操控变得可控；本发明涉及的单分子检测流程只需人工添加两次液体，其余操作均可以在磁场的调节下完成；大多数的“免疫复合物个体”在磁场操控下，能够精准、可控地在检测池中按照一定极性铺开，从而避免了高精密度芯片的加工，减少了生产成本。