一种细胞残留p24ELISA检测试剂盒及其使用方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及ipcg01n33领域，更具体地，本发明及一种细胞残留p24 elisa检测试剂盒及其使用方法。

背景技术：

1、细胞残留p24 elisa检测试剂盒就是利用p24蛋白作为检测指标，通过检测样品中p24蛋白的含量来确定慢病毒的滴度。目前，hiv-1p24蛋白检测多基于免疫吸附elisa的检测方法。

2、然而目前的elisa实验操作存在处理复杂，检测结果受外界、人工等因素影响导致出错率高的问题，同时不适宜处理样品数量大的情况，会出现样品与样品之间混淆，加样时孔与孔之间重复或者跳孔等。此外，目前还存在检测范围低，灵敏度低，精密度低的问题。

3、因此，需要提供一种细胞残留p24 elisa检测试剂盒及其使用方法解决上述问题。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的一些问题，本发明第一个方面提供了一种细胞残留p24elisa检测试剂盒，包括：包被酶标板、检测抗体、检测抗体稀释液、酶结合物、酶结合物稀释液、标准品、病毒裂解液、样本稀释液、洗液、终止液。

2、优选的，所述包被酶标板为hiv-1p24包被板。

3、本发明中包被酶标板随用随配。

4、在一种实施方式中，包被酶标板的制备方法包括：使用包被缓冲液包被抗体之后的混合包被液包被，然后进行洗板、封闭、洗板、保护后，即得。

5、在一种实施方式中，包被酶标板的制备方法如下：

6、1.包被：使用包被缓冲液包被抗体稀释至2μg/ml，然后以100μl/孔混合包被液于4℃过夜。

7、2.洗板：弃去各孔内液体，用1×pbst注满微孔(350μl/孔)，静置30秒后弃去孔内液体；重复2次，最后一次洗板完成后在面巾纸上拍干。

8、3.封闭：每孔中加入200μl 0.5wt％casein-na，37℃温箱放置1.5h。

9、4.洗板：弃去各孔内液体，用1×pbst注满微孔(350μl/孔)，静置30秒后弃去孔内液体；重复1次，最后一次洗板完成后在面巾纸上拍干。

10、5.保护：每孔中加入200μl 10wt％蔗糖溶液，室温温育1h；弃去各孔内液体，尽量拍干，置于干燥环境进行干燥。

11、在一种实施方式中，所述检测抗体为p24抗体。

12、使用本发明所述检测抗体稀释液将检测抗体稀释100倍。

13、在一种实施方式中，酶结合物为辣根过氧化物酶标记的链和亲霉素。

14、在一种实施方式中，酶结合物稀释液为hrp稀释液，使用该稀释液将酶结合物稀释100倍。

15、在一种实施方式中，所述标准品为hiv-1p24。

16、使用过程中，将标准品进行稀释2倍。

17、在一种实施方式中，所述病毒裂解液为ttiton-100。

18、优选的，所述病毒裂解液为0.25vol％ttiton-100。

19、在一种实施方式中，所述样本稀释液为0.5vol％casein-na。

20、在一种实施方式中，所述洗液为10xpbst。

21、本发明洗液使用时，使用去离子水稀释10倍。

22、在一种实施方式中，所述终止液为硫酸。

23、优选的，硫酸的浓度为0.1-1m，更优选的，硫酸的浓度为0.5m。

24、在一种实施方式中，所述细胞残留p24 elisa检测试剂盒还包括封板膜、说明书。

25、本发明第二个方面提供了一种细胞残留p24 elisa检测试剂盒的使用方法，包括：在包被酶标板上，添加病毒裂解液、标准品、稀释的样品、检测抗体，然后封板后震荡孵育；接着使用洗液洗涤后添加酶结合物后，封板震荡孵育，然后继续洗涤，接着显色之后测定。

26、在一种实施方式中，细胞残留p24 elisa检测试剂盒的使用方法，包括：

27、(1)使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生气泡。

28、(2)根据实验孔数量，确定所需的板条数目，剩余板条放回铝箔袋，密封。

29、(3)加样：在包被酶标板上，每孔加入50μl病毒裂解液，再加入50μl标准品、50μl稀释的样品；然后每孔加50μl检测抗体，之后用封板膜封板后置于室温振荡器，以500rpm的震荡速度孵育60分钟。

30、(4)洗涤：弃去各孔内液体，使用洗液以300μl/孔的规格注满微孔，静置30秒后弃去孔内液体；重复4次，每一次洗板完成后在滤纸上拍干。

31、(5)加酶结合物：每孔分别加100μl酶结合物，用封板膜封板置于室温振荡器，以500rpm的震荡速度孵育30分钟。

32、(6)洗涤：弃去各孔内液体，用洗涤液以300μl/孔的规格注满微孔，静置30秒后弃去孔内液体；重复4次，每一次洗板完成后在滤纸上拍干。

33、(7)显色：每孔分别加100μl底物显色液，轻微振荡混匀后用封板膜封板置25℃显色5～30分钟。

34、(8)测定：每孔加终止液100μl，轻微混匀。选择酶标仪主波长450nm，参考波长630nm，测定各孔吸光值(od值)。

35、本发明稀释的样品为样品的稀释至1万-10万倍的溶液。

36、本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

37、1.本发明采用双抗夹心法检测样本中hiv-1p24蛋白，将hiv-1p24特异性单克隆抗体包被在微孔板上，反应孔内加入标准品或待测样本，同时加入抗hiv-1p24的二抗，室温孵育，形成抗体-抗原-二抗复合物。洗涤除去未结合物，通过tmb显色程度指示样品中蛋白含量，且使用特定的包被酶标板、检测抗体、检测抗体稀释液、酶结合物、酶结合物稀释液、标准品、病毒裂解液、样本稀释液、洗液、终止液等，最后可以得到更可靠、准确的数据，解决了现有技术中常规的elisa实验操作需要提前一天进行板子包被，以及其他检验试剂的配制，时间周期长，且提前准备工作复杂，工作量大的问题。同事解决了常规的elisa检测实验受环境、人员操作影响较大，常规操作，整个物料准备、检测过程复杂，且出错率高，常常会因为样品数量大而出现样品与样品之间混淆，加样时孔与孔之间重复或者跳孔等问题。且本发明检测范围明显增大，为1.37-1000ng/ml，相对于本申请人之前申请文件的技术方案的检测范围(6.25-200pg/ml)显著提高，且本发明使用一步法，相对于之前申请文件的技术方案(三步法)也具有显著的优势，此外，本发明灵敏度为0.35ng/ml，精密度cv％<10％，re％<±15％。

38、2.本发明试剂盒去掉提前一天进行板子包被，以及其他检验试剂的配制操作步骤，试剂盒中有配置好的试剂，可直接用于实验，减少操作者的工作量，节约整个操作时间，只需要3小时即可完成检验，且若是用于连续性检测，可使检测结果更具比较性。

39、3.本发明试剂盒已完成方法学验证，检测快速，专一性强，性能可靠。

技术特征：

1.一种细胞残留p24 elisa检测试剂盒，其特征在于，包括：包被酶标板、检测抗体、检测抗体稀释液、酶结合物、酶结合物稀释液、标准品、病毒裂解液、样本稀释液、洗液、终止液。

2.根据权利要求1所述细胞残留p24 elisa检测试剂盒，其特征在于，所述包被酶标板为hiv-1p24包被板。

3.根据权利要求2所述细胞残留p24 elisa检测试剂盒，其特征在于，包被酶标板的制备方法包括：使用包被缓冲液包被抗体之后的混合包被液包被，然后进行洗板、封闭、洗板、保护后，即得。

4.根据权利要求1-3任一项所述细胞残留p24 elisa检测试剂盒，其特征在于，所述检测抗体为p24抗体。

5.根据权利要求4所述细胞残留p24 elisa检测试剂盒，其特征在于，酶结合物为辣根过氧化物酶标记的链和亲霉素。

6.根据权利要求5所述细胞残留p24 elisa检测试剂盒，其特征在于，所述病毒裂解液为ttiton-100。

7.根据权利要求6所述细胞残留p24 elisa检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为硫酸。

8.根据权利要求7所述细胞残留p24 elisa检测试剂盒，其特征在于，硫酸的浓度为0.1-1m。

9.根据权利要求8所述细胞残留p24 elisa检测试剂盒，其特征在于，所述细胞残留p24elisa检测试剂盒还包括封板膜、说明书。

10.一种根据权利要求1-9任一项所述细胞残留p24 elisa检测试剂盒的制备方法包括：在包被酶标板上，添加病毒裂解液、标准品、稀释的样品、检测抗体，然后封板后震荡孵育；接着使用洗液洗涤后添加酶结合物后，封板震荡孵育，然后继续洗涤，接着显色之后测定。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，具体涉及IPCG01N33领域，更具体地，本发明及一种细胞残留p24ELISA检测试剂盒及其使用方法。细胞残留p24ELISA检测试剂盒，包括：包被酶标板、检测抗体、检测抗体稀释液、酶结合物、酶结合物稀释液、标准品、病毒裂解液、样本稀释液、洗液、终止液。本发明试剂盒去掉提前一天进行板子包被，以及其他检验试剂的配制操作步骤，试剂盒中有配置好的试剂，可直接用于实验，减少操作者的工作量，节约整个操作时间，只需要3小时即可完成检验，且若是用于连续性检测，可使检测结果更具比较性。

技术研发人员：许金超,栗红建,张丹,李永锋,刘丽美,张伟男,蔡宇卿,郭彬彬
受保护的技术使用者：江苏谱新生物医药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16