一种蛋白质-DNA-分子复合物及其制备方法与流程

本发明免疫及生物检测，具体涉及信号放大的蛋白质-dna-分子复合物、尤其是hrp-dna-igg复合物及其制备方法。

背景技术：

1、酶免疫分析技术是利用酶标记的抗体或抗原为探针，来检测疾病相关的目标抗原或抗体的生物检测技术，被广泛应用于各种医疗及科研场景。常用的三种免疫学检测方法，免疫组化，western blot和酶联免疫吸附试验(elisa)均可使用酶标探针进行定位、定性和定量分析。酶标抗体或抗原具有敏感，有效期长，精准特异性好优点。辣根过氧化物酶(hrp)应用最为广泛，其分子量小，催化效率高，对酸碱和温度具有高度稳定性，且价格低廉，可以组合多种比色法、荧光法和发光法底物。

2、hrp可以直接标记在抗体或抗原上，也可以通过介质载体，将多个hrp和抗体组合起来，达到信号放大的目的。目前市场上的hrp直接标记二抗，每个抗体上hrp标记数量1-3个。此方法成本低，但是灵敏度不高，无法满足一些低丰度样品的检测要求，临床检测上基本已经不再使用。具有信号放大作用的商品化酶标二抗产品，目前主要基于生物素-链霉亲和素技术，葡聚糖技术和聚合物技术，后两者形成了目前临床应用的主要产品。这些技术大大提高了hrp/抗体的标记比例，提高了检测的灵敏度，但是仍然各自存在一定的局限：基于生物素-链霉亲和素的放大系统由于内源性生物素，存在背景干扰；基于葡聚糖技术的放大系统，以链状葡聚糖为骨架，连接多个hrp和多个抗体形成复合物。由于所用葡聚糖本身分子量大(50万)，结构松散，修饰多个hrp和二抗后的复合物具有很大的空间位阻，影响对抗原的高效结合。而目前最为先进的聚合物技术虽然相较于葡聚糖技术降低了空间位阻效应，但是得到的仍然是载体聚合物上负载多个hrp和多个二抗的复合物，没有对单独存在的二抗进行放大酶标，使得二抗实际工作浓度并未达到最优，尤其对于免疫组化(ihc)染色应用，多个串联的二抗不能灵活准确地显示抗原定位及分型。

3、中国发明专利申请202010769502.6提供了一种基于葡聚糖(dex)载体的dex-hrp-igg结合物，通过对葡聚糖进行氧化或者氧化氨化，然后结合hrp及二抗的方式，提高了酶标二抗信号放大的倍数和检测灵敏度。但是此技术存在三方面不足，一是载体所用的葡聚糖t500分子量为50万，仍然存在较大的空间位阻效应，二是难以控制葡聚糖上连接hrp和二抗的数量，三是hrp经过高碘酸钠氧化后比活会大幅降低，最终影响灵敏度。

4、中国发明专利申请202110651244.6提供了一种micropolymer-hrp-纳米抗体复合物的制备方法，此技术有两方面改进：一是采用分子量为常规二抗的10％～20％的纳米抗体做为二抗，减小了二抗的体积，提高了应用于免疫组化时的分子运动能力和穿透能力，进而提高了其染色强度和灵敏度；二是micropolymer为聚酰胺型树枝状高分子化合物或分子量小于40k的氨基葡聚糖、超支化氨基化聚二羟甲基丙酸酯或多聚赖氨酸。纳米抗体和micropolymer均采用异双功能偶联试剂修饰并反应连接。不足之处主要有两点，一是所述的micropolymer虽然基本涵盖了现有技术中的主要门类，但仍存在难以精确控制高分子聚合物上偶联的hrp和抗体的数量的弊端，且专利所述micropolymer hrp复合物中含有2-20个hrp，并未达到很高的信号放大倍数；二是和基于葡聚糖的放大系统一样，得到的仍然是载体聚合物上负载多个hrp和多个二抗的复合物，没有对单独存在的二抗进行放大酶标，使得二抗实际工作浓度并未达到最优，尤其对于免疫组化(ihc)染色应用，多个串联的二抗不能够灵活准确地显示抗原定位及分型。

技术实现思路

1、在一个方面，本发明提供了一种复合物，其形式为：蛋白x-dna-(分子y)n，其中n表示大于1的整数，优选地，n大于等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多，其中蛋白x和分子y分别通过接头与dna连接，优选分子y通过线性、四面体、六面体、八面体、十二面体或二十面体、更优选正四面体、正六面体、正八面体、正十二面体或正二十面体构型的dna与蛋白x连接。

2、在一个实施方案中，本发明提供了一种复合物，其中分子y通过接头分别与第一和第二单链dna(ssdna)连接，蛋白x通过接头与第三ssdna连接，其中所述第三ssdna包含序列b0，所述第一ssdna包含序列b0’和b1’，所述第二ssdna包含序列b0和b1，其中：b0和b0’、b1和b1’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链dna，由此与第三ssdna连接的蛋白x通过交替存在的与分子y连接的第一和第二ssdna而与多个分子y连接形成所述复合物。

3、在一个实施方案中，本发明提供了一种式(i)所示的复合物，

4、

5、其中：

6、蛋白x通过接头与位于ssdna序列b0的5’或3’端的序列bx连接形成(b0)bxx，分子y通过接头分别与位于ssdna序列(b0bsb1’)的5’或3’端的序列by和位于(b0bsb1)的5’或3’端的序列bz连接形成(b0bsb1)bzy和(b0’bsb1’)byy，

7、b0和b0’至少部分、优选完全序列互补以形成双链dna，b1和b1’至少部分、优选完全序列互补以形成双链dna，其中b0和b1序列可以相同或不同，

8、bs为间隔序列，各个bs可以相同或不同，以及

9、bx、by、bz是任意核苷酸序列，

10、由于交替存在的(b0bsb1)bzy和(b0’bsb1’)byy通过碱基配对形成双链dna，一个蛋白x分子与多个分子y连接。

11、在一个实施方案中，本发明提供了一种分子y通过四面体结构的双链dna分子与蛋白x连接形成的复合物，其中：

12、分子y通过接头分别与第一、第二和第三ssdna连接，然后第一、第二、第三与第四ssdna通过碱基配对形成的双链dna形成四面体结构，所述第一、第二、第三和第四ssdna均包含3个亚序列，其中所述第一、第二、第三和第四ssdna中每一个ssdna的所述3个亚序列分别与其余三个ssdna的所述3个亚序列之一互补，

13、蛋白x与第五ssdna通过接头连接，所述第五ssdna包含序列b0，

14、所述第四ssdna还包含与b0序列互补的序列b0’，

15、与蛋白x连接的第五ssdna通过b0与b0’配对形成的双链dna而与所述四面体结构的双链dna连接。

16、在一个方面，本发明提供了一种制备复合物：蛋白x-dna-(分子y)n的方法，包括：

17、-将蛋白x通过接头与单链dna连接，

18、-将分子y通过接头与单链dna连接，其中与蛋白x连接的单链dna和与分子y连接的单链dna至少部分互补，

19、-将蛋白x连接的单链dna与分子y连接的单链dna退火，

20、其中n表示大于1的整数，优选地，n大于等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多，优选地，n为2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选地，n为3、4、5或6。

21、在一个实施方案中，本发明提供了制备复合物的方法，包括：

22、-将分子y通过接头分别与第一和第二ssdna连接，

23、-将蛋白x通过接头与第三ssdna连接，

24、-将蛋白x连接的第三ssdna与分子y连接的第一ssdna接触，

25、-交替加入分子y连接的第二ssdna和分子y连接的第一ssdna，直至所需数目的分子y与蛋白x分子连接，

26、其中：

27、所述第一ssdna包含序列b0’和b1’，

28、所述第二ssdna包含序列b0和b1，

29、所述第三ssdna包含序列b0，

30、b0和b0’、b1和b1’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链dna，

31、由此与通过交替添加与分子y连接的第一和第二ssdna，一个蛋白x分子而与多个分子y连接形成所述复合物。

32、在一个实施方案中，本发明提供了一种分子y通过四面体结构的双链dna分子与蛋白x连接形成复合物的方法，包括：

33、(a)将分子y通过接头分别与第一ssdna、第二ssdna和第三ssdna连接；

34、(b)将(a)获得的第一ssdna、第二ssdna、第三ssdna与第四ssdna通过碱基配对形成四面体结构的双链dna，

35、(c)将蛋白x通过接头与第五ssdna连接，以及

36、(d)将(c)获得的第五ssdna与(b)获得的四面体结构的双链dna接触，形成所述复合物，

37、其中：

38、所述第一ssdna、第二ssdna、第三ssdna和第四ssdna均包含3个亚序列，其中所述四个ssdna中每一个ssdna的所述3个亚序列分别与其余三个ssdna的所述3个亚序列之一互补，

39、所述第五ssdna包含序列b0，

40、所述第四ssdna还包含与b0序列互补的序列b0’，

41、由此第五ssdna通过b0与b0’配对形成双链dna而与所述四面体结构的双链dna连接，形成所述复合物。

42、在一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含通过接头与单链dna连接的分子y和通过接头与单链dna连接的蛋白x，其中所述与分子y连接的单链dna和与蛋白x连接的单链dna至少部分互补，从而能够通过碱基互补配对形成双链dna而将蛋白x与分子y连接在一起。