二维可调孔板样品支架及其在检测前列腺抗原中的应用

本发明属于荧光免疫检测，具体涉及一种二维可调孔板样品支架及其在检测前列腺抗原中的应用。

背景技术：

1、前列腺癌是男性最常见的癌症之一，早期发现对患者的治疗和术后检测至关重要。然而，前列腺癌细胞的数量在早期阶段较少，因此在前期检测中难以检测。目前，临床上常用的前列腺癌筛查和诊断方法主要包括直肠前列腺超声、前列腺特异性抗原检测、多参数磁共振扫描等影像学检查。传统的前列腺抗原检测方法存在着特异性差、高假阳性率以及误诊的风险，这给前列腺癌的准确诊断和治疗带来了一定的挑战。

2、荧光检测是免疫检测的一种常用方法，其关键在于构建合适的荧光探针。荧光纳米材料以荧光强度高、抗光漂白的优点成为了医学领域热门的光学检测手段。其中，上转换纳米发光材料（ucnp）可以将低频光子转化为高频光子，通常是近红外光激发，可见光发射。而生物样本的自发荧光通常在紫外光激发下产生。因此，相较于传统的有机荧光染料和量子点，稀土掺杂的上转换荧光纳米材料近红外光激发、可见光发射的性能有效降低组织对光的吸收和散射，因此具有高信噪比、组织穿透深度大、无背景噪音干扰以及对生物组织几乎无损伤等优点。将上转换纳米材料作为荧光探针可提高检测灵敏度，从而提高前列腺癌检测的准确性。

3、上转换免疫吸附测定是以上转换纳米材料的光致发光为基础，原理同酶联免疫法，区别是酶联免疫法通过酶的催化作用，把待检测物质浓度转化为酶促反应的反应物或产物变量来检测。而上转换连接免疫吸附测定是用上转换材料替代了酶，利用捕获分子固定在基质上去结合反应物分子标记的上转换纳米材料。在洗去多余的非关联的反应物分子标记的上转换纳米材料后，发光强度与待测物质的含量呈正相关。目前基于酶联免疫法原理已经有可检测前列腺抗原的试剂盒，但检出限不够低。基于上转换荧光探针检测前列腺抗原，可提高灵敏度，但是要结合显微镜一起使用。而显微镜在使用过程中对焦复杂，不适合大批量检测。常规的酶标仪尚不能检测在980nm波长激发的上转换纳米材料，因而常规的酶标仪不能通过上转换荧光探针检测前列腺抗原。因此需要开发新的检测系统及方法，在通过上转换荧光探针提高检测灵敏度的同时，能够快速简便地批量检测前列腺抗原。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一种二维可调孔板样品支架及其在检测前列腺抗原中的应用。

2、具体技术方案如下：

3、一种二维可调孔板样品支架，包括第一旋钮、第二旋钮、左右移动平台、上下移动平台、载物台、第一齿轮、第二齿轮和连接杆，载物台的上表面开设有凸起结构，凸起结构的一侧边开设有第一齿纹结构，上下移动平台的下方开设有凹槽，上下移动平台的一侧开设有插入孔，第一齿轮设于连接杆的一端，且第一齿轮与第一齿纹结构啮合连接，连接杆的另一端依次穿过第二齿轮和插入孔，凹槽与凸起结构配合连接，左右移动平台的一端开设有第二齿纹结构，且第二齿纹结构插入上下移动平台的限位槽内，与第二齿轮啮合连接，左右移动平台的上表面设有孔板限位结构，第二旋钮与第二齿轮连接，第一旋钮与第一齿轮连接，第一齿轮的旋转带动上下移动平台相对载物台发生上下移动，第二齿轮的旋转带动左右移动平台相对上下移动平台发生左右移动。

4、进一步地，孔板限位结构包括限位条和至少两个限位卡件，限位条与第二齿纹结构平行设置，限位卡件设于限位条和第二齿纹结构之间，且对称设置，孔板安装在孔板限位结构处，支架整体按需进行上下左右移动，从而实现逐孔检测。

5、一种二维可调孔板样品支架在检测前列腺抗原中的应用，包括如下步骤：

6、1）采用高温共沉淀法制备nayf4:18% yb3+,2% er3+纳米粒子；

7、2）采用种子生长法制备nayf4:18% yb3+,2% er3+@nayf4核壳结构的荧光纳米材料ucnps；

8、3）将步骤2）所得的ucnps溶解于四氢呋喃中，另取聚乙二醇二羧酸(cpeg)溶解在四氢呋喃中，将两者混合，搅拌，加水和正己烷萃取，在去离子水中透析，使上转换荧光纳米材料转移至水中；

9、4）将步骤3）所得的经过cpeg修饰的ucnps分散在水中与标记抗体偶联，得到nayf4:18% yb3+,2% er3+@nayf4荧光探针；

10、5）在孔板上用移液枪向每孔中加入包被抗体溶液，在2-8 ℃冰箱中放置8 h，从冰箱中取出孔板，倒出孔内的液体，用洗涤缓冲液洗涤多次，每孔中加入bsa 封闭缓冲液封闭2 h，倒出孔中液体，洗涤，在孔中分别加入系列不同浓度的前列腺抗原溶液，静置1 h，倒出孔中液体，洗涤，向每孔中加入nayf4:18% yb3+,2% er3+@nayf4荧光探针纳米粒子溶液，静置1 h，倒出孔中液体，洗涤，拍干；

11、6）将孔板安装在孔板限位结构上，固定安装二维可调孔板样品支架，并设置好检测用光路系统，获得发射光谱，记录最佳发射峰的波长；

12、7）在最佳波长下，利用二维可调孔板样品支架移动孔板，对孔板进行逐孔荧光强度读数。

13、进一步地，步骤1）的具体操作过程为：将醋酸铒水合物、醋酸钇水合物、醋酸镱水合物溶于油酸和1-十八烯中，160℃下维持1h，达到配位目的，加入nh4f甲醇溶液和naoh甲醇溶液，在室温下维持30 min以达到成核的目的，抽至真空，通入氮气使反应始终在氮气氛围下进行，然后在290-300℃下维持1.5h，使晶体生长，反应结束后，反应液经过离心、洗涤、干燥得到nayf4:18% yb3+,2% er3+纳米粒子。

14、进一步地，步骤2）的具体操作过程为：将醋酸钇水合物溶于油酸和1-十八烯中，160℃下维持1h，达到配位目的，冷却至室温，加入步骤1）的nayf4:18% yb3+,2% er3+纳米材料作为核，加入nh4f甲醇溶液和naoh甲醇溶液，在室温下维持30 min，抽至真空，通入氮气使反应始终在氮气氛围下进行，然后在290-300℃下维持1.5h，反应结束后，反应液经过离心、洗涤、干燥得到ucnps。

15、进一步地，ucnps的颗粒粒径为20-60nm。

16、进一步地，步骤4）的具体操作过程为：将edc和nhs溶解在ph为6.1的0.1m的mes水溶液中，与步骤3）的经过cpeg修饰的ucnps混合，使其在室温下活化30-60min，将此溶液与前列腺标记抗体的硼酸缓冲液混合，室温下孵育60-120 min，孵育结束后离心得到上转换荧光探针，使其溶解在测定缓冲液中超声10 min，存放2-8 ℃冰箱中。

17、进一步地，步骤4）中ucnps与cpeg的比例为1:5、1:10或1:15。

18、进一步地，步骤5）中所述的包被抗体溶液为50mm碳酸氢钠或碳酸钠与0.05%叠氮化钠组成的ph=9.6的缓冲液，洗涤缓冲液为0.01%tweeen 20、0.05%叠氮化钠与50 mm磷酸二氢钠或磷酸氢二钠溶液组成的ph=7.4的缓冲液，bsa 封闭缓冲液为1%牛血清白蛋白、0.05%叠氮化钠与50 mm磷酸二氢钠或磷酸氢二钠溶液组成的ph=7缓冲液。

19、进一步地，步骤6）中的光路系统包括激光光源、准直器、第一凸透镜、第二凸透镜、狭缝和光电倍增镜，准直器设置在激光光源前，激光光源通过准直器调节光源至孔板上，光源折射至第一凸透镜，接着直射至第二凸透镜后穿过狭缝射至光电倍增镜得到发射光谱，记录最佳发射峰波长。

20、本发明相比现有技术具有以下优点：

21、稀土掺杂的上转换纳米发光材料在近红外光激发、可见光发射的特性，能有效降低组织对光的吸收和散射，因此具有高信噪比、组织穿透深度大、无背景噪声干扰以及对生物组织几乎无损伤等优点，ucnps作为肿瘤标志物的理想荧光探针，其多色发光性质为高灵敏度探针设计提供了很好的基础，因此将上转换纳米材料作为荧光探针来降低对前列腺抗原的检出限；

22、前列腺抗原试剂盒一般选用酶标仪检测，由于酶标仪无法提供激发上转换纳米材料的激光光源，因此，前列腺抗原结合上转换荧光探针不能用酶标仪检测，基于上转换荧光探针检测前列腺抗原，可结合显微镜用以检测，而显微镜在使用过程中对焦复杂，不适合大批量检测，本方法设计了可用于商用荧光仪的一种二维可调96孔板样品支架及光路系统，可在商用荧光仪基础上实现兼具980nm等近红外光激光光源激发上转换荧光探针，并以96孔板模式批量检测前列腺抗原浓度的功能。解决了商用酶标仪未能以980nm等近红外光激光光源激发，商用荧光仪以近红外光激光光源激发时，仅能进行单个样品测试的问题可有效降低前列腺抗原的检测成本和技术门槛。