一种用于检测偏肺病毒的检测卡及其应用的制作方法

本技术涉及体外诊断免疫检测，尤其是涉及一种用于检测偏肺病毒的检测卡及其应用。

背景技术：

1、偏肺病毒感染是人体感染人偏肺病毒(hmpv)后引起的一种急性呼吸道传染病，全年散发，多发生于冬末及春初。hmpv属于肺炎病毒科，偏肺病毒属，为有包膜的单股负链rna病毒，平均直径大约200nm。hmpv包括a和b两个基因型，可分为a1、a2、b1、b2四个亚型，这些亚型常常同时流行，各亚型病毒传播力和致病性未见明显差别。

2、hmpv感染大多表现为轻度自限性疾病，部分患者因出现毛细支气管炎、肺炎、慢性阻塞性肺疾病(copd)急性加重和支气管哮喘急性发作等并发症需要住院治疗，免疫功能低下者可进展为重症肺炎，出现急性呼吸窘迫综合征(ards)或多器官功能不全等，甚至导致死亡。hmpv感染者是主要传染源，主要通过飞沫和密切接触传播，也可通过接触被病毒污染的物品间接传播，从潜伏期末到急性期都有传染性。潜伏期3-9天，多为3-6天。多表现为上呼吸道感染症状如发热、咳嗽、鼻塞、流涕、声音嘶哑等，约1周左右症状逐渐缓解。病情严重者可出现毛细支气管炎、重症肺炎和ards，copd患者感染后病情可加重，支气管哮喘患者可诱发急性发作。严重下呼吸道感染多见于幼儿、老年人等人群。肺移植、造血干细胞移植等免疫功能低下人群感染后症状更重，病死率也相对较高。

3、目前常用的实验室检测人偏肺病毒的测试方法有病毒核酸检测法，病毒的培养分离以及血清学检测，其中，病毒培养是hmpv检测的金标准，但hmpv生长缓慢，分离阳性率偏低，更多是用于实验研究以及药敏试剂等。临床检测主要采用逆转录pcr方法，hmpv的n基因的核酸序列和氨基酸序列都比较保守，保守性分别为91.2％和98.4％，常用于hmpv核酸检测的目的基因；g基因的核酸序列和氨基酸序列差异较大，保守性分别为79％和59.2％，可用于分型，通过real time rt-pcr扩增hmpv的这两个基因，进行测序就可以鉴别诊断出hmpv的四种亚型，另有研究显示仅检测n基因也能鉴定出ampv和hmpv所有亚型。虽然pcr方法具有较高的特异性和灵敏度，但是需要专业的技术人员、贵重的仪器以及专门的实验场地。因此需要提供一种具有检测快速、简便、准确，低成本等特点的检测偏肺病毒的方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本技术提供一种采用免疫乳胶检测法检测偏肺病毒的检测卡和试剂盒，利用所述检测卡和包括所述检测卡的试剂盒对偏肺病毒进行检测时，具有检测快速、简便、准确、成本低等特点，能够更广泛地应用于偏肺病毒的临床检测。

2、为此，本技术第一方面提供了一种用于检测偏肺病毒的检测卡，所述检测卡包括试纸条，所述试纸条包括：

3、底板，和沿层析方向依次固定于所述底板上的样品垫、结合垫、nc反应膜和吸水纸，且所述样品垫、结合垫、nc反应膜和吸水纸顺次接触；

4、所述结合垫上喷涂有结合垫处理液，所述结合垫处理液中包含红色乳胶颗粒-偏肺病毒抗体1偶联物；所述nc反应膜远离结合垫的一端设置有质控线，所述质控线上固定有能够与所述偏肺病毒抗体1结合的抗体；所述nc反应膜靠近结合垫的一端设置有检测线，所述检测线上固定有偏肺病毒抗体2。

5、本技术中，所述底板上样品垫、结合垫、nc反应膜和吸水纸的具体搭接方式为：nc反应膜粘贴在底板上，nc反应膜的两端分别搭接有结合垫的一端和吸水纸的一端，结合垫的另一端粘贴在底板上，样品垫的一端搭接在结合垫的一端，样品垫的另一端粘贴在pvc板上，吸水纸的另一端粘贴在底板上。

6、本技术所述检测卡中的试纸条运用双抗体夹心法，对待测样品中偏肺病毒进行检测。具体地，所述试纸条的结合垫上含有红色乳胶颗粒-偏肺病毒抗体1偶联物，若待测样品中含有偏肺病毒检测物，待测样品中所含的偏肺病毒检测物与结合垫上的红色乳胶颗粒-偏肺病毒抗体1上的抗体反应后，生成偏肺病毒(抗原)-偏肺病毒抗体1(抗体)-红色乳胶颗粒偶联物，通过层析作用上述偶联物到达nc反应膜上，并与nc反应膜的检测线上固定的偏肺病毒抗体2(抗体)进一步进行反应，形成双抗体夹心复合物，进而将其固定于检测线上，使检测线上呈现出一条红色条带，通过将检测线上红色条带的颜色与色卡图进行比对，进而可对待测样品中偏肺病毒的含量作出定性判断。

7、本技术中由于结合垫上含有的红色乳胶颗粒-偏肺病毒抗体1偶联物是过量的，其与nc反应膜检测线上固定的偏肺病毒抗体2反应后，过量的红色乳胶颗粒-偏肺病毒抗体1继续在层析作用下移动并到达nc反应膜的质控线上，并与质控线上固定的能够与所述偏肺病毒抗体1结合的抗体反应，进而将其固定于质控线上，使质控线上同样呈现出一条红色条带。检测结束后，通过观察质控线上红色条带的有无，进而对该检测卡检测结果的准确性进行判定。只有当质控线上出现红色条带时，才能根据检测线上红色条带的强度对待测样品中偏肺病毒的含量出定性判断；相反地，若质控线上未出现红色条带时，说明检测过程或采样有问题，需要重新进行检测。

8、本技术利用所述检测卡对待测样品中偏肺病毒的检测具有检测快速、简便、准确、成本低等特点，不需要专业的技术人员，也不需要借助贵重的仪器以及专门的实验场地，能够广泛地应用于偏肺病毒的临床检测。

9、本技术中对所述nc反应膜的质控线上固定的能够与所述偏肺病毒抗体1结合的抗体的具体种类没有明确限定，只要其能够与偏肺病毒抗体1结合即可。在本技术的一些具体实施方式中，所述能够与所述偏肺病毒抗体1结合的抗体为羊抗鼠igg抗体。本技术所述结合垫上固定的偏肺病毒抗体1以及nc反应膜检测线上固定的偏肺病毒抗体2可以为均能够与偏肺病毒结合的单克隆抗体，且偏肺病毒抗体1与偏肺病毒抗体2与偏肺病毒上所结合的抗原表位不同。

10、本技术中，所述底板可以为pvc底板。

11、在一些实施方式中，所述结合垫处理液中包括ph值为7.5～8.5的0.1～0.3m的tris-hcl缓冲液、1～3wt％的蔗糖、0.1～0.5wt％的海藻糖、0.5～2.0v/v％的吐温20、0.1～0.5v/v％的曲通x-100、1.0～5.0mg/ml主动型异嗜性抗体阻断剂、1.0～5.0mg/ml被动型异嗜性抗体阻断剂和0.1～5.0wt％的红色乳胶颗粒-偏肺病毒抗体1偶联物。

12、本技术中所述结合垫处理液中的所添加的海藻糖可以为无水海藻糖或二水海藻糖，所添加的主动型异嗜性抗体阻断剂和被动型异嗜性抗体阻断剂均能够作为阻断剂，二者相互配合，能够协同消除非特异性吸附和非特异性反应，提高检测卡检测结果的准确性。

13、在一些实施方式中，所述结合垫处理液中主动型异嗜性抗体阻断剂和被动型异嗜性抗体阻断剂的质量比为(1～2):1，优选为1.25:1。本技术通过将结合垫处理液中主动型异嗜性抗体阻断剂和被动型异嗜性抗体阻断剂的质量比控制在上述范围内，能够使二者更好地发挥协同作用。

14、本技术中的主动型异嗜性抗体阻断剂的市售产品，本领域技术人员可以通过常规采购后进行使用。

15、在一些具体实施方式中，所述结合垫处理液中包括ph值为8.0的0.1m的tris-hcl缓冲液、2wt％的蔗糖、0.5wt％的二水海藻糖、0.5v/v％的吐温20、0.5v/v％的曲通x-100、2.5mg/ml主动型异嗜性抗体阻断剂、2.0mg/ml被动型异嗜性抗体阻断剂和0.1wt％的红色乳胶颗粒-偏肺病毒抗体1偶联物。

16、在一些实施方式中，所述红色乳胶颗粒-偏肺病毒抗体1偶联物的制备方法包括如下步骤：

17、s1，将活化后的红色乳胶颗粒与待标记的偏肺病毒抗体1混合后进行偶联反应，获得偶联有偏肺病毒抗体1的红色乳胶颗粒；

18、s2，对所述偶联有偏肺病毒抗体1的红色乳胶颗粒进行封闭处理，获得红色乳胶颗粒-偏肺病毒抗体1偶联物；

19、其中，所述封闭处理采用的封闭剂包括乙醇胺、明胶和甘氨酸；所述乙醇胺、明胶和甘氨酸的质量比为1:(0.2～0.5):(0.2～0.5)。

20、本技术步骤s2中进行封闭处理时所采用的封闭剂中同时包括乙醇胺、明胶和甘氨酸，乙醇胺为小分子无机化合物，明胶和甘氨酸为大分子有机化合物，在三者的协同配合下能对偶联有偏肺病毒抗体1的红色乳胶颗粒表面的非特异性位点进行有效封闭，进而降低非特异性吸附反应和非特异性交叉反应，进而提高检测卡检测结果的准确性。

21、在一些优选的实施方式中，所述乙醇胺、明胶和甘氨酸的质量比为1:0.25:0.25。本技术通过优化乙醇胺、明胶和甘氨酸的质量关系，能使三者之间更好地发挥协同作用。

22、本技术中，对红色涂胶颗粒进行活化时采用的活化剂包括edc和nhs，edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)是个可溶于水的碳二亚胺，用作羧基的活化试剂，其与nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)联用对红色涂胶颗粒活化后，能够提高活化后的红色乳胶颗粒与待标记的偏肺病毒抗体1的偶联效率。

23、在一些具体实施方式中，所述红色乳胶颗粒-偏肺病毒抗体1偶联物的制备方法包括以下步骤：

24、(1)采用标记缓冲液对红色乳胶颗粒进行4倍体积稀释，颠倒洗涤红色乳胶颗粒，离心并弃上清，然后再次加入同体积标记缓冲液对洗涤后的红色乳胶颗粒进行重悬，获得红色乳胶颗粒混悬液；

25、(2)将edc和nhs分别按照2.1mg/ml和0.4mg/ml的比例加入到上述红色乳胶颗粒混悬液，在室温条件下于旋转混悬仪上搅拌活化1小时；

26、(3)在13500rpm条件下离心15分钟，弃上清，去除所有过量的edc和nhs，然后用同体积标记缓冲液进行重悬、超声，获得活化后的红色乳胶颗粒的混悬液；

27、(4)在活化后的红色乳胶颗粒的混悬液中按0.125mg/ml比例添加偏肺病毒抗体1，然后放旋转混悬仪室温标记过夜，获得含偶联有偏肺病毒抗体1的红色乳胶颗粒的混悬液；

28、(5)在含偶联有偏肺病毒抗体1的红色乳胶颗粒的混悬液中按30ul/ml的体积比加入封闭剂溶液，室温搅拌30分钟，进行封闭处理；封闭剂溶液中包括6wt％的乙醇胺，1.5wt％的明胶和1.5wt％的甘氨酸；

29、(6)在13500rpm离心15分钟，弃上清，用偶联物稀释液将沉淀物定容至原体积，吹散红色乳胶颗粒沉淀，超声2分钟，室温搅拌2-4小时；

30、(7)在13500rpm离心15分钟，弃上清，用偶联物稀释液将沉淀物定容至原体积，吹散红色乳胶颗粒沉淀，超声2分钟，得到含红色乳胶颗粒-偏肺病毒抗体1偶联物的原液。

31、本技术中，所采用的标记缓冲液中包括ph值为6.0～7.0的0.1～0.3m的mes缓冲液和0.1～0.5wt％的nacl。优选地，所采用的标记缓冲液中包括ph值为6.5的0.1m的mes缓冲液和0.24wt％的nacl。

32、本技术中，所采用的偶联物稀释液中包括ph值为8.0～9.0的0.1～0.3m的tris-hcl缓冲液、0.5～1.5wt％的bsa和0.01～0.03wt％的叠氮钠。优选地，所采用的偶联物稀释液中包括ph值为8.5的0.2m的tris-hcl缓冲液、1.0wt％的bsa和0.03wt％的叠氮钠。

33、在一些实施方式中，所述结合垫的制备方法包括：将所述结合垫处理液喷涂于未处理的结合垫上，干燥后制得所述结合垫；其中述所述结合垫处理液的喷涂量为1.5～2.0μl/cm。

34、本技术中结合垫的干燥可以在温度为40～50℃的烘箱中进行，干燥的时间可以为过夜干燥。

35、在一些实施方式中，所述nc反应膜的制备方法包括如下步骤：

36、步骤1，将包含偏肺病毒抗体2的配制溶液划线固定至检测线上；

37、步骤2，将包含能够与所述偏肺病毒抗体1结合的抗体的配制溶液划线固定至质控线上。

38、本技术中，所述检测线与质控线之间相互平行。本技术对检测线与质控线之间的间距没有明确限定，其为本领域的常规间距。在一些具体实施方式中，所述检测线与质控线的间距可以为3～7mm，具体根据观察窗和nc反应膜规格微调。

39、在一些实施方式中，所述包含偏肺病毒抗体2的配制溶液中包括1.0～5.0v/v％的海藻糖、8.0～12.0v/v％的pbs缓冲液、0.1～0.5v/v％的fitc水溶液、0.2～1.0v/v％的30～50mm edta溶液和1.0～5.0mg/ml的偏肺病毒抗体2；

40、所述包含能够与所述偏肺病毒抗体1结合的抗体的配制溶液中包括1.0～5.0v/v％的海藻糖、0.1～0.5v/v％的fitc水溶液、0.2～1.0v/v％的30～50mm edta溶液和1.0～5.0mg/ml的能够与所述偏肺病毒抗体1结合的抗体。

41、在一些具体实施方式中，所述包含偏肺病毒抗体2的配制溶液中包括3.0v/v％的海藻糖、10.0v/v％的pbs缓冲液、0.5v/v％的fitc溶液、0.67v/v％的50mm edta溶液和1.5mg/ml的偏肺病毒抗体2；

42、所述包含能够与所述偏肺病毒抗体1结合的抗体的配制溶液中包括3.0v/v％的海藻糖、10.0v/v％的pbs缓冲液、0.5v/v％的fitc溶液、0.67v/v％的50mm edta溶液和1.0mg/ml的能够与所述偏肺病毒抗体1结合的抗体。

43、在一些实施方式中，所述fitc水溶液中包括5.0～10.0wt％的fitc粉末和5.0～10.0v/v％的pbs缓冲液；所述pbs缓冲液的ph值为6.5～7.0，且其中包括1.0～1.5wt％的na2hpo4、0.1～0.3wt％的nah2po4和6.0～10.0wt％的nacl。

44、在一些具体实施方式中，所述fitc水溶液中包括10.0wt％的fitc粉末和10.0v/v％的pbs缓冲液；所述pbs缓冲液的ph值为6.8，且其中包括1.15wt％的na2hpo4、0.228wt％的nah2po4和8.77wt％的nacl。

45、本技术中所述包含偏肺病毒抗体2的配制溶液以及包含偏肺病毒抗体2的配制溶液中的fitc在紫外下能够发出荧光，用来检测nc反应膜的检测线和质控线上相应溶液喷涂的是否均匀。

46、本技术通过采用上述组成的包含偏肺病毒抗体2的配制溶液以及包含偏肺病毒抗体2的配制溶液，能使制得的检测线和质控线上相应的抗体更为稳定，进而与偏肺病毒-偏肺病毒抗体1-红色乳胶颗粒偶联物发生特异性结合，且能有效消除非特异性结合反应，提高检测结果的准确性。

47、本技术中，所述包含偏肺病毒抗体2的配制溶液在所述nc反应膜的检测线上的喷涂量为0.5～1.5ul/cm，所述包含偏肺病毒抗体2的配制溶液在所述nc反应膜的检测线上的喷涂量为0.5～1.5ul/cm。

48、在一些实施方式中，所述检测卡还包括外壳，所述外壳包括能相互扣合的上盖和下盖，所述上盖对应所述试纸条上nc反应膜的位置设有观察窗，对应所述试纸条上样品垫的位置设置有加样孔。

49、本技术中，所述外壳用于对所述试纸条进行封装。

50、本技术第二方面提供了一种用于检测偏肺病毒的试剂盒，所述试剂盒包括样品缓冲液和如本技术第一方面所述的检测卡。

51、本技术中所述试剂盒中含有所述检测卡，使得利用所述试剂盒能够对待测样品中的偏肺病毒进行检测时，具有检测速度快、检测成本低、操作简便，且检测结果准确性高、特异性强等优势。

52、在一些实施方式中，所述样品缓冲液中包括1.0～2.0wt％的tris、0.5～1.0wt％的nah2po4、0.5～1.0wt％的nacl、0.5～1.5v/v％的吐温20、0.1～0.5v/v％的triton-x100、0.5～1.5v/v％的酪蛋白和0.1～0.5v/v％的proclin-300。

53、在一些具体实施方式中，所述样品缓冲液中包括1.21wt％的tris、0.6wt％的nah2po4、0.877wt％的nacl、1.0v/v％的吐温20、0.1v/v％的triton-x100、1.0v/v％的酪蛋白和0.1v/v％的proclin-300。

54、本技术中所述样品缓冲液用于对采集的待测样品进行稀释和处理，在一定程度上抵消或减轻外加样本对溶液酸碱度的影响，以进一步提高检测结果的准确性。样品缓冲液中的proclin-300为防腐剂，起到防腐作用；酪蛋白能够降低非特异性的作用，减少杂蛋白特异性结合；nacl能够到减少信号强度，消除假阳性结果。

55、在一些实施方式中，所述试剂盒中还包括色卡图。

56、本技术中所述色卡图具体如图1所示，色卡图上具有色卡值在0～5范围内的红色条带，检测结束后，通过将检测线上红色条带的颜色与色卡图进行比对，可以确定出检测线上红色条带的色卡值，并进一步确定出检测线的显色强度，进而可对待测样品中偏肺病毒的含量作出定性判断。本技术中，所述色卡图上不同色卡值所对应显色强度具体如表1所示。

57、表1

58、 色卡值 显色强度 0-0.5 - 0.5 ± 0.5-1 + 1-2 ++ 2-3 +++ 3-4 ++++ 4-5 +++++

59、本技术的有益技术效果为：本技术所提供的用于检测偏肺病毒的检测卡能够对待测样品中的偏肺病毒进行定性检测，检测准确性和灵敏度高，检测特异性强，检测过程无需专业的技术人员，也不需要借助贵重的仪器以及专门的实验场地，操作简便、快速，检测成本低，能够较好地应用在偏肺病毒的临床检测中，应用前景广阔。