测定幽门螺杆菌分型抗体的乳胶免疫试剂盒及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物检测，尤其涉及测定幽门螺杆菌分型抗体的乳胶免疫试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术：

1、胃癌是全球第五大常见癌症，而且是死亡率位居第三的癌症。胃癌的发生是多因素共同作用的结果，包括感染、环境因素、营养状况、饮食和遗传等。幽门螺杆菌(helicobacter pylori，h.pylori，简称hp)感染为慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤和胃癌的主要病因。全球约50％的人口感染hp，并且在中国的感染率高，根除幽门螺杆菌是治疗消化性溃疡、胃癌预防的可行措施。

2、根据幽门螺杆菌分泌的毒素情况，分为有毒株和无毒株两种类型，即ⅰ型和ⅱ型。ⅰ型：产细胞毒素hp菌株，即：cag a或vac a抗体表达阳性，这类菌株感染能使胃上皮细胞出现空泡、变形和损害，引起溃疡和诱发癌变。ⅱ型：不产生细胞毒素的hp菌株，即：cag a和vac a抗体表达阴性，这一类hp菌株毒性较小，感染后一般仅引起慢性浅表性胃炎而无临床症状。已知ⅰ型菌株比ⅱ型菌株能引起更严重的胃粘膜损伤与炎症以及更高的患胃癌的概率。幽门螺杆菌感染人群庞大，存在自行检测需求，特别是用于根除治疗后疗效判断的个体检测。建立基于个体和家庭的检测技术，可提升相关诊断的可及型、便捷性，并有效降低医疗成本。而目前，市面上缺乏能够居家自测的幽门螺杆菌分型抗体检测方法。

3、综上所述，现需要一种操作简便、结果准确、能够居家检测的幽门螺杆菌分型抗体检测试剂。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提供测定幽门螺杆菌分型抗体的乳胶免疫试剂盒及其制备方法与应用，具有操作便捷、快速、结果准确并且能够自行检测的特点。

2、本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

3、第一方面，本发明提供了一种测定幽门螺杆菌分型抗体的乳胶免疫试剂盒，所述试剂盒中包括检测试剂卡，所述检测试剂卡包括样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和底板，所述释放垫上包含有标记有鼠抗人igg抗体的抗体微球，所述硝酸纤维素膜上依次设置有第一检测线、第二检测线和质控线，所述第一检测线上包被有urease抗原，所述第二检测线上包被有caga抗原和vaca抗原复合物，所述质控线上包被有羊抗鼠igg。

4、结合第一方面，在一些实施方式中，所述样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次安装在底板上，所述样品垫的一端粘贴在底板上，另一端叠放在释放垫的一端上；所述释放垫的另一端叠放在硝酸纤维素膜的一端上，所述吸水纸的一端叠放在硝酸纤维素膜的另一端上，所述吸水纸的另一端粘贴在底板上，所述第一检测线、第二检测线和质控线均无遮挡。

5、第二方面，本发明提供了一种测定幽门螺杆菌分型抗体的乳胶免疫试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

6、微球标记，将活化后的微球加入活化缓冲液中，超声波重悬分散，随后加入0.5～1mg的鼠抗人igg，用涡旋混合器充分混匀，在震荡培养箱中于37℃、250rpm混旋孵育2.5～3h，在3～5℃、12500～13500xg条件下离心10～20min，去除上清，随后加入微球封闭液进行微球封闭，得到抗体微球，将抗体微球加入微球保存液中保存；

7、释放垫的制备，将抗体微球以0.8～1.2μl/cm的量喷涂在预处理后的乳胶结合垫上，干燥制得包被有标记有鼠抗人igg抗体的抗体微球的释放垫；

8、硝酸纤维素膜的制备，将硝酸纤维素膜粘贴到底板上，将urease抗原、caga抗原和vaca抗原复合物分别用印膜缓冲液稀释成0.5～1mg/m l，将羊抗鼠igg用印膜缓冲液稀释成1.5～2mg/m l，然后以1.5～2μl/cm的量分别依次喷涂在硝酸纤维素膜上，干燥制得第一检测线、第二检测线和质控线；

9、检测试剂卡的组装，将样品垫、释放垫、吸水纸安装在底板上，得到检测试剂卡。

10、结合第二方面，在一些实施方式中，所述微球的活化包括以下步骤：

11、将微球加入活化缓冲液中，在3～5℃、12500～13500xg条件下离心10～20min，去除上清；

12、再加入活化缓冲液，使用超声波破碎机超声重悬微球，然后加入含10mg/ml的nhs的活化缓冲液，用涡旋混合器充分混匀，再加入含10mg/ml的edc的活化缓冲液，用涡旋混合器充分混匀，在震荡培养箱中37℃、250rpm混旋孵育20～30min，最后在3～5℃、12500～13500xg条件下离心10～20min，去除上清，得到活化后的微球。

13、结合第二方面，在一些实施方式中，所述活化缓冲液的组成如下：45～55mmol/l的吗啡啉乙磺酸和纯化水。

14、结合第二方面，在一些实施方式中，所述微球封闭液的组成如下：45～55mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、质量百分浓度为0.8～1.2％的牛血清白蛋白、质量百分浓度为0.08～0.12％的proclin300，以及余量的纯化水；

15、或者，所述微球保存液的组成如下：45～55mmol/l的吗啡啉乙磺酸、质量百分浓度为0.8～1.2％的牛血清白蛋白、质量百分浓度为1.8～2.2％的海藻糖、质量百分浓度为0.08～0.12％的proclin300，以及余量的纯化水。

16、结合第二方面，在一些实施方式中，所述乳胶结合垫的预处理如下：将乳胶结合垫浸没在乳胶结合垫优化缓冲液中，然后干燥并控制湿度在30％以下，所述乳胶结合垫优化缓冲液包括浓度为45～55mmol/l的三羟甲基氨基甲烷、质量百分浓度为0.8～1.2％的牛血清白蛋白、质量百分浓度为0.4～0.6％的吐温20、质量百分浓度为1.8～2.2％的蔗糖、质量百分浓度为0.08～0.12％的proclin300、以及余量的纯化水。

17、结合第二方面，在一些实施方式中，所述印膜缓冲液包括浓度为0.01～0.03mol/l、ph为7～7.4的pbs缓冲液、质量百分浓度为0.8～1.2％的海藻糖、浓度为8～12mmol/l的乙二胺四乙酸、质量百分浓度为0.08～0.12％的proclin300。

18、第三方面，本发明提供了上述测定幽门螺杆菌分型抗体的乳胶免疫试剂盒或上述制备方法制备得到的乳胶免疫试剂盒在制备测定幽门螺杆菌分型抗体的产品中的应用。

19、结合第三方面，在一些实施方式中，所述产品中还包括样本稀释液，所述样本稀释液包括浓度为0.02mol/l、ph为7.2的pbs缓冲液、质量百分浓度为2％葡萄糖、质量百分浓度为0.1％的proclin300。

20、本发明的测定幽门螺杆菌分型抗体的乳胶免疫试剂盒，采用乳胶免疫法检测全血中的urease抗体、caga抗体和vaca抗体，根据检测结果能够判断幽门螺杆菌的感染类型，进而为临床上的相关疾病提供辅助诊断。本发明的乳胶免疫试剂盒具有操作便捷、快速、结果准确的优点。经试验证明，本发明的乳胶免疫试剂盒在判断幽门螺杆菌的感染类型的应用中，检测出的阴性符合率为100％，阳性符合率为100％。

21、本发明的测定幽门螺杆菌分型抗体的乳胶免疫试剂盒能够自行检测，不需要任何特殊仪器设备，检测成本低；试剂盒操作简便，不需要专业人员操作。