一种快速分选杂交瘤单克隆抗体的方法与流程

本申请涉及生物，尤其涉及一种快速分选杂交瘤单克隆抗体的方法。

背景技术：

1、抗体是由b细胞产生并能特异性靶向抗原的免疫球蛋白，而由单个b细胞产生的、仅识别一个特定抗原表位的、高度均一的抗体就是单克隆抗体(monoclonal antibodies，mab)。单克隆抗体不仅是生物化学、分子生物学和医学研究中必不可少的工具，其在临床治疗上的应用也以革命性的速度改进了多种疑难杂症的治疗方法。传统的单克隆抗体是基于杂交瘤技术(hybridoma technology)来实现的，而经过近些年的发展，单克隆抗体制备方法已不仅局限于杂交瘤技术，噬菌体展示技术(phage display)、人源抗体转基因小鼠(human antibody-producing mice)和单b细胞抗体技术(single b cell antibodytechnology)也都陆续登上舞台，虽然这些新技术存在各种局限，但都已广泛应用于单克隆抗体筛选；并且，些技术都不完全是独立存在的，如果能充分利用各技术的优点，采用灵活的方法将各技术优化组合就能更加高效、快速地进行抗体开发。

2、传统的小鼠杂交瘤单克隆抗体制备方法是先将融合后的杂交瘤细胞使用hat筛选培养，然后将能分泌目的抗体的杂交瘤细胞通过有限稀释法进行亚克隆，最终筛选出阳性单克隆细胞，这一过程通常需要1-3个月的时间，因此需要耗费较多的人力物力；目前有采用半固体培养基对融合后的杂交瘤细胞进行hat筛选，并通过单集落挑选的方式将单克隆细胞集落挑选至96孔板培养的方法，利用该方法可以缩短亚克隆实验的流程并减少抗体开发时间，但方法中的hat筛选仅能去除未能成功融合的杂交瘤细胞，且挑选出的单集落细胞并不一定可以分泌特异抗体，因此细胞挑选、培养、鉴定所需的工作量依然很大。但是如果缩短hat筛选时间，提前进行流式分选或亚克隆，杂交瘤细胞增殖数量虽然会减少，从而减少工作量，但细胞融合后状态不稳定，过早进行分选或亚克隆会导致单细胞成活率较低、sp2\0细胞筛选不充分，最终导致单克隆细胞培养阳性率降低；因此如何提供一种分选杂交瘤单克隆抗体的方法，以实现融合细胞经过hat筛选后能够稳定存在且提高单克隆细胞培养阳性率，是目前亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、本申请提供了一种快速分选杂交瘤单克隆抗体的方法，以解决现有技术中经过hat筛选后细胞融合后状态不稳定同时单克隆细胞培养阳性率降低的技术问题。

2、第一方面，本申请提供了一种快速分选杂交瘤单克隆抗体的方法，所述方法包括：

3、将骨髓瘤细胞和免疫后的脾脏细胞进行杂交瘤融合，并进行预培养，得到预融合细胞；

4、采用hat培养基对预融合细胞进行稀释，并在第一预设培养温度下进行第一培养，后在第二预设培养温度下进行第二培养，得到hat筛选后的杂交瘤细胞；

5、荧光标记hat筛选后的所述杂交瘤细胞，并进行流式分选，后进行单克隆培养，得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞；

6、其中，所述第一预设培养温度＞所述第二预设培养温度。

7、可选的，所述第一预设培养温度为36℃～37℃，所述第二预设培养温度为30℃～36℃。

8、可选的，所述第一培养的时间为1d～3d，所述第二培养的时间为2d～6d。

9、可选的，所述第一培养和所述第二培养的气体氛围包括二氧化碳，所述二氧化碳的含量≥5％。

10、可选的，所述骨髓瘤细胞和所述脾脏细胞的体积之比为1:2～4。

11、可选的，所述第二培养还包括在培养至最后一天时将hat培养基更换为ht培养基。

12、可选的，所述标记hat筛选后的所述杂交瘤细胞，并进行流式分选，后进行单克隆培养，得到分泌杂交瘤单克隆抗体的杂交瘤细胞，包括步骤：

13、采用hat筛选后的所述杂交瘤细胞制备细胞悬液，并进行细胞密度稀释，得到细胞悬液稀释液；

14、混合所述细胞悬液稀释液和标记液，并进行孵育，后进行重悬，得到标记单细胞悬液；

15、对所述标记单细胞悬液进行细胞分选，并进行单克隆培养，得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。

16、可选的，所述细胞密度稀释的目标密度为5*105个/ml～5*107个/ml。

17、可选的，所述方法还包括：

18、混合蛋白抗原和弗式完全佐剂，并将混合物注射入动物模型中，得到首次免疫动物模型；

19、混合所述蛋白抗原和弗式不完全佐剂，并将混合物注射入所述首次免疫动物模型中，得到二次免疫动物模型；

20、对所述二次免疫动物模型进行第三次、第四次免疫，后进行脾脏细胞提取，得到免疫后的脾脏细胞。

21、可选的，所述蛋白抗原和所述弗式完全佐剂的体积之比为1:1；所述蛋白抗原和所述弗式不完全佐剂的体积之比为1:1。

22、本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

23、本申请实施例提供的一种快速分选杂交瘤单克隆抗体的方法，相比传统的单克隆抗体的筛选过程，由于哺乳动物细胞的最适培养温度为36℃～37℃，因此当温度降低由于杂交瘤融合细胞的自我保护机制，使得杂交瘤融合细胞的代谢率减少、使得细胞增殖减缓，而杂交瘤融合细胞在融合前期的状态较为脆弱，因此先在杂交瘤融合细胞的hat筛选之前进行第一培养和第二培养，可以利用第一培养使杂交瘤融合细胞有所恢复，同时大部分未融合的sp2\0细胞死亡，再采用第二培养，继续对杂交瘤融合细胞的培养和sp2\0细胞筛选，同时由于第二培养阶段采用了在37℃以下的培养温度，使得杂交瘤融合细胞的增殖速度减缓，待到进行流式分选或亚克隆时细胞总量和重复克隆数量都会比全程在37℃培养时低，由于融合后的杂交瘤溶液细胞与未融合的sp2\0细胞表面标志物不同，因此使用流式抗体和抗原进行标记后可将目的细胞区分开来并进行单细胞培养，从而可以在hat筛选后杂交瘤融合细胞能够稳定存在同时还能提高单克隆细胞培养阳性率；且采用上述两步培养后的细胞直接使用流式抗体和抗原进行标记即可筛选出分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，避免了后续的有限稀释法进行筛选，因此还可以减少细胞亚克隆的实验步骤，以缩短实验周期，以及可以降低细胞培养所需的试剂和耗材消耗。

技术特征：

1.一种快速分选杂交瘤单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一预设培养温度为36℃～37℃，所述第二预设培养温度为30℃～36℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养的时间为1d～3d，所述第二培养的时间为2d～6d。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养和所述第二培养的气体氛围包括二氧化碳，所述二氧化碳的含量≥5％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述骨髓瘤细胞和所述脾脏细胞的体积之比为1:2～4。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二培养还包括在培养至最后一天时将hat培养基更换为ht培养基。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记hat筛选后的所述杂交瘤细胞，并进行流式分选，后进行单克隆培养，得到分泌杂交瘤单克隆抗体的杂交瘤细胞，包括步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述细胞密度稀释的目标密度为5*105个/ml～5*107个/ml。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述蛋白抗原和所述弗式完全佐剂的体积之比为1:1；所述蛋白抗原和所述弗式不完全佐剂的体积之比为1:1。

技术总结
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种快速分选杂交瘤单克隆抗体的方法；所述方法包括：将骨髓瘤细胞和免疫后的脾脏细胞进行杂交瘤融合，并进行预培养，得到预融合细胞；采用HAT培养基对预融合细胞进行稀释，并在第一预设培养温度下进行第一培养，后在第二预设培养温度下进行第二培养，得到HAT筛选后的杂交瘤细胞；荧光标记HAT筛选后的杂交瘤细胞，并进行流式分选，后进行单克隆培养，得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞；其中，所述第一培养的温度＞所述第二培养的温度；该方法将融合后的细胞进行分段式低温培养，该方法可在HAT筛选过程中降低细胞增殖速度，且不影响阳性细胞的存活或细胞培养阳性率，还可以缩短实验周期并降低成本。

技术研发人员：牛梦溪,罗绍祥,陈云
受保护的技术使用者：武汉生之源生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15