一种具有高分辨率和低信号噪声的固态纳米孔及其制备方法

本发明属于纳米孔测序领域，特别是一种同时具有高分辨率和低信号噪声的“三明治”结构固态纳米孔的制备方法。

背景技术：

1、纳米孔测序是新一代dna测序和蛋白质测序的方法之一，其测序原理为：用1个含有纳米孔的薄膜隔断2个电解液腔,接着分别在2个腔体中插入电极并施加电压,诱发稳定的跨越纳米孔的离子电流。dna、多肽和蛋白质等被分析物分子在外加电场的驱动下逐一通过纳米孔,流过纳米孔的离子产生的电流信号会受到孔内待测物阻塞的影响而发生明显的变化,即造成离子电流阻塞。通过对离子电流阻塞信号的幅值、持续时间和间隔时间等特征的分析可解析出被分析物的结构特征等信息。理论上来说对高分辨率离子电流信号的分析能够依次识别序列中每个碱基或氨基酸的类型,进而获得整个dna序列或蛋白序列的信息,即所谓的dna测序和蛋白质测序。

2、在传统固态纳米材料膜上(包括氧化硅或氮化硅等)钻取的传统固态材料纳米孔具有化学和机械鲁棒性、几何形状可控以及与现有半导体制造技术兼容性好的优点。但是受限于传统固态膜材料的厚度，即纳米孔的长度，通常超过5nm，而单个碱基或者氨基酸的长度仅为～0.5nm，由此导致dna，多肽或蛋白质链中的许多碱基或氨基酸会同时占据在纳米孔中，使得达到单碱基或单氨基酸分辨率的纳米孔测序变得极其困难。

3、另一方面，石墨烯和二硫化钼等新兴的二维材料拥有原子级的厚度(～0.5nm)。所以在二维材料中钻取的纳米孔理论上每次可以容纳一个或少数个碱基/氨基酸，有望在理论上实现单碱基/氨基酸分辨率的电流读取，可以用作传统固态纳米孔的替代品。然而，二维材料膜超薄的厚度却会导致二维材料纳米孔存在远高于传统固态纳米孔的电流噪声。产生噪声的原因一是二维材料纳米孔机械稳定性相对较弱，容易产生额外的机械波动；二是二维材料纳米孔相对于同半径的传统固态纳米孔厚度较薄，体积较小，造成孔内载流子数量较少。所以，二维材料纳米孔通常表现出较低的离子电流信噪比，影响了检测设备的精确性。

4、因此，制备用于测序设备中同时拥有低电流噪声和高分辨率的固态纳米孔已成为本领域亟待解决的技术难题。

技术实现思路

1、针对现有纳米孔测序设备中所用的传统固态纳米孔和二维材料纳米孔在电流信号方面的不足，本发明提供了一种同时具有高分辨率和低信号噪声的“三明治”结构的固态纳米孔及其制备方法。

2、具体而言，本技术是通过如下技术方案实现的：

3、首先，本技术提供了一种具有高分辨率和低信号噪声的固态纳米孔，该固体纳米孔自下而上由固态材料膜i、二维材料膜、固态材料膜ii组成；

4、上述固态材料膜i、固态材料膜ii的材质均包括氮化硅、氧化硅、三氧化二铝、氧化锌、氧化钛或hfo2中的一种；固态材料膜i和固态材料膜ii的材质可以相同，也可以不同。优选的，上述固态材料膜i和ii被支架支撑后，悬空区域的面积大于50nm×50nm，以保证后续钻取的纳米孔距离支架边缘足够远，避免支架对纳米孔产生影响。在具体实施中，固态材料膜i和固态材料膜ii的厚度优选大于3nm且小于50nm。

5、所述二维材料膜的材质包括石墨烯，六方氮化硼，二硫化钼，二硫化钨或mxenes中的一种；该二维材料膜的面积优选大于1.2nm×1.2nm，厚度优选小于2nm；

6、所述固态材料膜i、二维材料膜和固态材料膜ii的中心区域均设有小孔，且这三个小孔相互连通；固态材料膜i和固态材料膜ii中心区域的小孔构成前庭区域，二维材料膜中心区域的小孔构成收缩区域；上述前庭区域的半径均大于收缩区域的半径，而且收缩区域直径优选大于1nm。

7、进一步，上述固态纳米孔中，收缩区域的孔电阻rconst大于固态纳米孔总电阻rtotal的五分之一以上；所述前庭区域的孔电阻rvest和接入电阻ra,vest之和大于收缩区域接入电阻ra,const；

8、所述收缩区域的孔电阻接入电阻ra,const＝(2σrconst)-1；其中lconst为收缩区域的厚度，rconst为收缩区域的半径，σ为检测时使用的电解液的电导率；

9、所述前庭区域的孔电阻接入电阻为ra,vest＝(2σrvest)-1；其中ltotal为步骤2)所述三明治状膜的总厚度，rvest为前庭区域的半径；

10、所述固态纳米孔的总电阻为rtotal＝rconst+ra,const+rvest+ra,vest。

11、其次，本技术提供了一种同时具有高分辨率和低信号噪声的固态纳米孔的制备方法，包括以下步骤：

12、1)在固态材料膜i表面制备一层二维材料膜(如图1所示)；即通过化学气相沉积(cvd)在被支架支撑的固态材料膜沉积一层二维材料膜，或者通过人工将提前通过cvd方法制备或机械剥离的二维材料膜转移到固态材料膜表面。

13、上述固态材料膜i材料包括氮化硅、氧化硅、三氧化二铝、氧化锌、氧化钛和hfo2中的任一种，属于本领域传统固态材料，他们的制备方法均为常规方法，如文献“nat revmater 5,931-951(2020)”所公开。

14、在具体实施中，一般使用中间镂空的支架支撑固态材料膜进行操作，对支架材料无特殊要求，但固态材料膜边缘的长度需要大于支架镂空区域的边缘长度，以保证固态材料膜能够放置在支架上。此外固态材料膜需要完全覆盖住支架的镂空区域以保证完全隔绝膜两边的区域。

15、本技术对上述固态材料膜i形状无具体要求，优选的，上述传统固态材料膜被支架支撑后，悬空区域的面积大于50nm×50nm，以保证后续钻取的纳米孔距离支架边缘足够远，避免支架对纳米孔产生影响。固态材料膜i的厚度优选大于3nm且小于50nm。

16、上述二维材料膜包括石墨烯，六方氮化硼，二硫化钼，二硫化钨和mxenes膜中的任一种。

17、优选的，上述二维材料膜的面积大于1.2nm×1.2nm以保证有充足的面积用于开孔，且厚度小于2nm以保证后续加工的收缩区域只能容纳单个或少数个碱基/氨基酸，本技术对该二维材料膜形状无具体要求。

18、上述通过cvd在固态材料膜沉积一层二维材料膜的方法为本领域常规技术，如文献“nature 467,190-193(2010)”所记载；通过人工将提前制备的二维材料膜转移到固态材料膜表面的方法同样为常规技术，如文献“acs nano 13,3042-3053(2019)”所公开。传统固态材料膜包括氮化硅、氧化硅、三氧化二铝、氧化锌、氧化钛和hfo2中的任一种。

19、2)在二维材料膜表面上覆盖一层固态材料膜ii，从而形成“三明治”状(固态膜-二维材料膜-固态膜)的膜结构(如图1所示)。

20、该“覆盖”是指通过原子层沉积(ald)的方法在二维材料膜表面上沉积一层固态材料膜，如文献“acs nano 6,441-450(2012)”所公开，或者通过人工将传统固态材料膜放到二维材料膜表面；其制备方法与步骤1)中的相同。

21、上述固态材料膜ii材料包括氮化硅、氧化硅、三氧化二铝、氧化锌、氧化钛和hfo2中的任一种；

22、固态材料膜ii的厚度优选大于3nm且小于50nm，固态材料膜i与固态材料膜ii厚度可以相同，也可以不相同。

23、3)刻蚀掉上述三明治状的膜靠近膜中心区域的固态材料膜i和固态材料膜ii，以在部分区域内暴露出二维材料膜层(如图1所示)上下表面。刻蚀掉部分膜后形成的凹陷区域即为该新型固态纳米孔的前庭区域。

24、上述的刻蚀方法包括聚焦离子或电子束、干刻蚀，电子或离子束辐照或激光辅助光热刻蚀等方法，均为本领域常规方法，如文献“nat rev mater 5,931-951(2020)”所公开。

25、4)通过聚焦离子或电子束方法在暴露出的二维材料膜中打一个孔(如图1所示)。该位于二维材料膜上的小孔即称为收缩区域。经过刻蚀和钻孔两步之后，贯穿的前庭区域和收缩区域共同组成为“沙漏”状的新型固态纳米孔(如图2所示)。

26、其次，本技术还提供了利用上述方法制备的具有高分辨率和低信号噪声的固态纳米孔。

27、将该固态纳米孔用于生物(如蛋白质、dna等)测序装置(如axopatch 200b或南京大学龙亿涛课题组开发的cube-d0设备)时，该纳米孔等效于收缩区域的孔电阻和接入电阻以及前庭区域的孔电阻和接入电阻串联而成的电路，如图2所示。根据电导方程和各区域的尺寸(孔半径和孔长度)可以得到该纳米孔各区域的电阻。在该孔中，收缩区域的孔电阻其中lconst为收缩区域的厚度，rconst为收缩区域的半径(如图2所示)，σ为测序时使用的电解液的电导率。收缩区域的接入电阻为ra,const＝(2σrconst)-1。前庭区域的孔电阻为其中ltotal为三明治状膜的总厚度，rvest为前庭区域的半径(如图2所示)。前庭区域的接入电阻为ra,vest＝(2σrvest)-1。新型固态纳米孔的总电阻为rtotal＝rconst+ra,const+rvest+ra,vest。

28、优选的，上述“沙漏”状的新型固态纳米孔的截面尺寸应满足前庭区域的半径大于收缩区域的半径，且收缩区域直径大于1nm以保证dna链，多肽和蛋白质链能够穿过纳米孔。

29、优选的，上述新型固态纳米孔的前庭区域的半径需通过下述收缩区域和前庭区域的电阻分布关系求得。新型固态纳米孔的电阻分布应满足收缩区的孔电阻(rconst)大于总电阻(rtotal)的五分之一以上，从而保证纳米孔具有单碱基或单氨基酸分辨率。上述沙漏形状的新型固态纳米孔的电阻分布应同时满足前庭区域的孔电阻(rvest)和接入电阻(ra,vest)之和大于收缩区的接入电阻(ra,const)，从而保证纳米孔具有较低的电流噪声。

30、本发明提供了的一种同时具有高分辨率和低信号噪声的“三明治”结构固态纳米孔的制备方法。该纳米孔的通道呈现为“沙漏”状，两端管径较粗的区域称为前庭，而中间较细的区域称为收缩。在纳米孔测序中，该新型纳米孔的前庭区域用于容纳大量的离子(载流子)以降低电流噪声，而厚度薄且半径小的收缩区域用于放大位于该区域内的单个或少数个碱基/氨基酸的电流信号，从而实现高分辨率检测。因此，该新型纳米孔的电流信号能够同时具有单碱基或单氨基酸分辨率和远低于二维材料纳米孔的电流噪声。此外，该纳米孔结构简单，加工条件较为成熟，易于制造。该装置可应用于纳米孔电化学分析领域，dna测序领域和多肽/蛋白测序领域等。