一种紫草天然染料的指纹图谱检测方法

本发明属于纺织品染整，特别是涉及一种利用指纹图谱的分析方法检测紫草天然染料的结构、质量以及染料中各染色成分间的含量组成及比例关系，本发明可确保每批次间紫草天然染料组成成分的一致性，以此来保证染色指标、性能的稳定性。

背景技术：

1、紫草，别名紫草根，是紫草科植物新疆紫草及内蒙紫草的根。前者习惯叫软紫草，后者称为硬紫草。具有凉血、活血、透疹、解毒疗疮的作用。紫草，除了作为药用以外，自古以来，一直作为传统的天然染料，应用于纺织品工业中。紫草中的活性成分是萘醌类结构的化合物，新疆紫草中主要活性成分包括紫草素、乙酰紫草素、o-异丁酰紫草素、o-β,βˊ-二甲丙烯酰阿卡宁、o-β,β，γ-三甲丁烯酰紫草素、o-β-羟基异戊酰基紫草素等，也是构成紫草天然染料中的主要活性物质。由于产地、采收期等因素的影响，这些成分在不同的药材中分布是不均衡的，从而，也影响到紫草天然染料在生产过程中，每批次间差异很大，不仅是色差影响，还关系到染料的其他重要的染色性能指标。

2、目前已公布天然染料标准中，对于染料的主要成分测定，只有纯度测定和染料的天然性鉴别，所采用的分析方法通常是高效液相色谱法和薄层层析法，测定的指标都是单一成分或单一杂质，不能全面分析染料的组成成分、杂质对染料的影响及其影响染料性能的成分递变规律。本发明首次利用高效液相色谱法，建立了同时控制多成分、多指标的指纹图谱分析技术，解决了紫草天然染料在实际的生产加工、质量控制中出现的上述问题。

3、目前关于紫草天然染料的质量检测方法较少，本发明采用高效液相色谱法，建立紫草天然染料的指纹图谱检测方法，对紫草天然染料的的成分鉴别、质量评价以及质量标准的制定具有重要的意义。

技术实现思路

1、发明目的：本发明属于纺织品染整技术领域，特别是涉及一种利用指纹图谱的分析方法技术来控制天然染料的结构及组成，及各成分间的比例关系。即选取紫草药材，经过有效部位研究、科学提取，开发出紫草天然植物染料，同时采用高效液相色谱分离手段，对染料中的有效成分进行分离、指纹图谱分析、检测控制，来确定染料中各染色成分间的含量组成及比例关系，通过这种方法，来进一步确保每批次间染料组成成分的一致性，以此来保证染色指标、性能的稳定性。

2、本技术通过采用高效液相色谱法，并对色谱条件进行合理控制，使本技术获得的指纹图谱能够对紫草天然染料进行更全面的质量控制，检测方法简便快速、准确性高、重复性好，稳定性好，耐用性好，为紫草天然染料的质量标准研究奠定良好的研究基础。

3、技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

4、一种紫草天然染料的指纹图谱检测方法，包括如下步骤：

5、(1)供试品溶液的制备：称取紫草天然染料，粉碎，精密称取适量，置量瓶中，加入甲醇适量，超声提取，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，得供试品溶液；

6、(2)混合对照品溶液的制备：分别取紫草素、乙酰紫草素、o-异丁酰紫草素、o-β,βˊ-二甲丙烯酰阿卡宁、o-β,β，γ-三甲丁烯酰紫草素、o-β-羟基异戊酰基紫草素对照品适量，加甲醇制成浓度均为0.2mg/1ml的混合对照品溶液；

7、(3)指纹图谱的测定：取供试品溶液和对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

8、(4)将步骤(3)中获得的供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012a；选择不同批次紫草天然染料色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成紫草天然染料的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

9、作为优选方案，以上所述的紫草天然染料的指纹图谱检测方法，所述的紫草天然染料，是指选取新疆紫草药材，分别以60-90℃石油醚和95％乙醇为溶剂，提取的两部分提取物：取检验合格的紫草药材适量，粉碎，过40～60目筛，加8～10倍量石油醚超声提取1～3次，每次各20～30分钟，合并提取液，回收石油醚后另器保存；残渣挥干溶剂后，加6～10倍量的95％乙醇浸泡1～3次，合并浸出液，回收乙醇，浓缩液加一定体积量的2～5％naoh溶液,使溶液由紫红色变为蓝色，过滤，滤液加浓盐酸调至不再产生沉淀，过滤，沉淀加蒸馏水洗至中性，离心，沉淀与石油醚提取物合并，制得紫草天然染料。

10、作为优选方案，以上所述的紫草天然染料的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中色谱条件如下：色谱柱：c18；流动相a：乙腈；流动相b：体积浓度为0.01％～0.5％的酸水溶液，梯度洗脱；柱温：25～35℃；流动相流速为0.5～1.2ml/min；进样体积为5～15μl；检测波长为230～290nm。

11、作为优选方案，以上所述的紫草天然染料的指纹图谱检测方法，所述梯度洗脱条件如下：0～5min，50％a；5～8min，50～60％a；8～15min，68-70％a。

12、作为优选方案，以上所述的紫草天然染料的指纹图谱检测方法，所述供试品溶液和对照品溶液的注入量为5μl，流动相流速为1.0ml/min。

13、作为优选方案，以上所述的紫草天然染料的指纹图谱检测方法，所述检测波长为274nm。

14、作为优选方案，以上所述的紫草天然染料的指纹图谱检测方法，其特征在于：所述的流动相b酸水溶液浓度为0.05％，所述的酸水溶液是指甲酸、乙酸、磷酸、三氯乙酸、三氟乙酸的水溶液。

15、作为优选方案，以上所述的紫草天然染料的指纹图谱检测方法，所述的流动相b为0.05％的三氟乙酸溶液。

16、作为优选方案，以上所述的紫草天然染料的指纹图谱检测方法，指纹图谱中有10个共有峰，以9号峰为参照物，各共有峰的保留时间、相对保留时间和相对峰面积分别为：

17、1号峰：保留时间2.460min，相对保留时间0.225，相对峰面积0.059；

18、2号峰：保留时间3.546min，相对保留时间0.324，相对峰面积0.070；

19、3号峰：保留时间4.147min，相对保留时间0.379，相对峰面积0.171；

20、4号峰：保留时间4.434min，相对保留时间0.405，相对峰面积0.053；

21、5号峰：保留时间5.491min，相对保留时间0.501，相对峰面积1.720；

22、6号峰：保留时间7.772min，相对保留时间0.710；相对峰面积0.455；

23、7号峰：保留时间8.489min，相对保留时间0.775；相对峰面积0.098；

24、8号峰：保留时间9.299min，相对保留时间0.849；相对峰面积0.528；

25、9号峰：保留时间10.954min，相对保留时间1.000；相对峰面积1.000；

26、10号峰：保留时间12.020min，相对保留时间1.097；相对峰面积2.069。

27、作为优选方案，以上所述的紫草天然染料指纹图谱检测方法，指纹图谱中2号峰为紫草素、5号峰为乙酰紫草素、7号峰为o-异丁酰紫草素、8号峰为o-β,β，γ-三甲丁烯酰紫草素、9号峰为o-β,βˊ-二甲丙烯酰阿卡宁、10号峰为o-β-羟基异戊酰基紫草素。

28、指纹图谱检测条件的优化：

29、1、在色谱条件进行优化方面

30、本发明对检测波长进行考察，提取205nm、225nm、245nm、274nm、280nm处的色谱图，发现检测波长为274nm时，色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选274nm为检测波长；

31、2、本发明对流速(1ml/min、0.9ml/min、0.8ml/min、0.6ml/min)进行筛选，因紫草天然染料中的成分在1ml/min的流速下峰形较好且分离效果较好，最终选择在流速为1.0ml/min梯度条件。

32、3、本发明比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1％甲酸，乙腈和0.05％磷酸水，乙腈-0.1％磷酸水，乙腈-0.05％三氟乙酸水等不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果。结果发现以流动相a乙腈，流动相b为0.05％的三氟乙酸溶液流动相时，紫草天然染料中各成分分离效果较好，故最终选定以乙腈和0.05％的三氟乙酸水为流动相。

33、4、在确定最佳流动性组成后，本发明通过大量实验筛选最佳的梯度洗脱程序，实验发现，采用0-5min，50％a；5-8min，50-60％a；8-15min，68％-70％a的梯度洗脱方式时，可实现指纹图谱中各色谱峰的良好分离度。

34、有益效果：本发明提供的指纹图谱检测方法和现有技术相比具有以下优点：

35、(1)本发明的液相色谱条件，能有效地将紫草天然染料中的萘醌类活性成分分离检测，分离效果佳，分析检测速度快(只需15分钟)且成本低，流动相梯度洗脱比例简单、易操作，是首次创立用指纹图谱的技术方法来控制紫草天然染料的质量；

36、(2)本发明采用紫草中代表性萘醌类成分紫草素、乙酰紫草素、o-异丁酰紫草素、o-β,βˊ-二甲丙烯酰阿卡宁、o-β,β，γ-三甲丁烯酰紫草素、o-β-羟基异戊酰基紫草素六种对照品作为参比对照物，分别进行定性对照，方法可靠有效；

37、(3)本发明能为紫草天然染料产品的质量控制、质量标准的制定提供有利的数据支持，对产品工艺开发起到重要指导作用；

38、(4)本发明具有操作方便，检测快速，方法稳定性、精密度高、重现性好等优点，可准确可靠的检测和控制紫草天然染料成品的质量。