一种血余炭高效液相特征图谱、含量的测定及应用的制作方法

本发明属于分析检测，尤其涉及一种血余炭高效液相特征图谱、含量的测定及应用。

背景技术：

1、血余炭首载于《神农本草经》，为我国传统中药材。苦，平。归肝、胃经。具有收敛止血，化瘀，利尿等功效，用于治疗吐血，咯血，衄血，血淋，尿血，便血，崩漏，外伤出血，小便不利。血余炭人的头发主含优角蛋白，此外尚含脂肪及黑色素和铁、锌、铜、钙、镁等。制炭后有机物被破坏，灰分中主含钠、钾、钙、铁、铜、锌等元素。目前我国对于血余炭药材的基础研究较为薄弱，文献报道有炮制方面的研究，以其止血效果作为考察指标[1]，有报道以无机离子、灰分、浸出物等指标进行质量控制研究[2-4]，但其标准控制指标简单，难以有效控制药材质量，导致药材及其成药制剂质量良莠不齐等现象长期存在，制约了血余炭药用资源开发与有效利用。本研究对血余炭药材、饮片、标准汤剂、提取物和配方颗粒等相关制剂的质量评价和资源开发利用提供依据。

2、目前血余炭药材及其复方制剂现有的质量研究较少，从未见在高效液相分析检测及含量测定方面的相关报道，缺少一种有效手段对其进行质量控制。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种血余炭高效液相特征图谱、含量的测定及应用，该发明旨在构建一种血余炭高效液相特征图谱方法和含量测定方法，全面反映血余炭及其相关制剂的质量水平，为血余炭药材、饮片及其相关制剂在质量控制方面提供指导。

2、本发明提供了一种血余炭高效液相特征图谱的构建方法，包括以下步骤：

3、a)将血余炭原料采用盐酸水解，滤过，取滤液蒸干，残渣采用盐酸溶解，得到供试品溶液；所述血余炭原料为血余炭药材、饮片、标准汤剂、中间体或其配方颗粒；

4、b)将所述供试品溶液衍生化后采用高效液相色谱法测定，得到血余炭高效液相特征图谱；色谱条件包括：c18柱，流动相a为乙腈，流动相b为0.02％磷酸溶液，梯度洗脱。

5、本发明首次建立高效液相特征图谱方法用于血余炭药材、饮片、标准汤剂、提取物、配方颗粒及其相关制剂的检测；本发明在建立血余炭的特征图谱过程中，确认了7个共有特征峰，指认了4个成分，并对其相对保留时间和相对峰面积进行了研究，保证了其化学组成稳定性和使用安全性。

6、本发明中所述0.02％磷酸溶液为体积分数，具体为0.02％磷酸水溶液。

7、本发明具体实施例中以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)。具体实施例中，采用的色谱柱为kromasil100-5-c18，4.6mm×250mm，5μm(色谱柱1)；shimadzu shim-pack gist c18，4.6mm×250mm，5μm(色谱柱2)；watersxbridge c18，4.6mm×250mm，5μm(色谱柱3)；

8、本发明中所述水解采用的盐酸的浓度为3～9mol/l；水解盐酸浓度为9mol/l时，脯氨酸和丙氨酸的含量较高，水解较完全，故实施例中水解盐酸浓度优选采用9mol/l；

9、水解的温度为105～155℃，水解的时间为1～4h；具体实施例中，水解的温度为150℃，水解的时间为2h。

10、所述血余炭的质量和盐酸的体积为(0.1～0.5)g:(10～20)ml；具体实施例中，水解盐酸9mol/l加入量为10ml时，脯氨酸和丙氨酸即可充分水解；且称样量为0.2g的色谱图峰形较好，峰面积适中，所以血余炭的质量和9mol/l盐酸的体积为0.2g:10ml。

11、残渣采用0.1mol/l盐酸溶解。残渣溶解至25ml容量瓶中，加0.1mol/l盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。

12、具体实施例中，血余炭特征图谱的构建方法中供试品溶液的制备过程具体包括：

13、取供试品原料研细后，取0.2g，精密称定，置具塞水解管中，精密加入9mol/l盐酸溶液10ml，密塞，称定重量，置150℃水解2小时，放冷，再称定重量，用9mol/l盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml至蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1mol/l盐酸溶液使溶解，转移至25ml量瓶中，加0.1mol/l盐酸溶液至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

14、本发明中所述梯度洗脱具体为；

15、0～35min，a相：12～20％，b相：88～80％；

16、35～40min，a相：20～35％，b相：80～65％；

17、40～55min，a相：35％，b相：65％；

18、55～65min，a相：35～80％，b相：65～20％；

19、65～73min，a相：80％，b相：20％。

20、在本发明中，流动相的流速为0.8～1.2ml/min，色谱图峰形、分离效果均符合要求；具体实施例中，流动相的流速为1.0ml/min；进样量为10μl；

21、柱温为25～35℃，色谱图峰形、分离效果均符合要求；具体实施例中，柱温为25℃、30℃或35℃，优选为30℃。

22、本发明通过对光谱图脯氨酸和丙氨酸的最大吸收波长，并参考色谱图，在检测波长为245nm时指标峰有较大吸收，色谱图基线更平稳，故检测波长为245nm；

23、理论板数按氨基酸峰计算不低于5000。

24、所述流动相b为0.02％磷酸溶液，体积分数；具体为0.02％磷酸水溶液。

25、本发明还包括参照物溶液的制备：

26、取血余炭对照药材和9mol/l盐酸混合水解，放冷，过滤，取续滤液蒸干，残渣加0.1mol/l盐酸溶解，得到对照药材参照物溶液；

27、将丙氨酸、脯氨酸分别采用0.1mol/l盐酸溶解，制得50μg/ml的对照品参照物溶液。

28、血余炭对照药材的质量和9mol/l盐酸的体积比为1g：(9～11)ml；具体实施例中，血余炭对照药材的质量和9mol/l盐酸的体积比为1g:10ml。续滤液的体积和0.1mol/l盐酸的体积比为1:5。

29、本发明提供了一种血余炭中脯氨酸和丙氨酸含量的测定方法，包括以下步骤：

30、s1、将血余炭供试品采用盐酸水解，滤过，取滤液蒸干，残渣加0.1mol/l盐酸溶解，得到供试品溶液；

31、将丙氨酸、脯氨酸分别采用0.1mol/l盐酸溶解，得到对照品参照物溶液；

32、s2、将对照品参照物溶液和供试品溶液中分别衍生，得到衍生的对照品参照物溶液和衍生的供试品溶液；

33、s3、将衍生后的对照品参照物溶液和供试品溶液注入液相色谱仪中，采用高效液相色谱法，在相同的检测条件下分别获得所述衍生的对照品溶液和衍生的供试品溶液中化学成分的色谱图；

34、根据所述对照品参照物溶液的浓度、所述对照品参照物溶液在色谱图中的峰面积以及血余炭中与所述对照品参照物溶液中相对应的成分在色谱图中的面积，且基于步骤s3中的检测条件，以外标法计算，得到血余炭中脯氨酸和丙氨酸的含量。

35、本发明建立血余炭的含量测定方法，以脯氨酸和丙氨酸的总量为指标，可以从整体上、宏观上控制血余炭及其相关制剂的内在质量，保证了药物的疗效，使药材及其相关制剂得到了更为正规的质量控制；方法稳定性好，精密度高、重现性好，便捷且易于掌握。

36、在本发明中，所述对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液和供试品溶液中分别均衍生的过程包括：

37、将对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液和供试品溶液中分别均加入异硫氰酸苯酯的乙腈溶液和三乙胺的乙腈溶液，放置，得到衍生产物；将所述衍生产物和正己烷混合，振摇，放置，取下层溶液，滤过，取滤液，得到衍生化的对照药材参照物溶液、衍生化的对照品参照物溶液和衍生化的供试品溶液。

38、所述衍生产物和正己烷的体积比为1:0.98～1.1，优选为1:1。

39、本发明采用浓度分别为8.1340μg/ml、10.1675μg/ml、20.3350μg/ml、40.6700μg/ml、101.6750μg/ml的脯氨酸溶液，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定，得到峰面积，以浓度(x，μg/ml)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标绘制响应曲线y＝16822.3413x-13903.6133，r2＝0.9999。因此，本发明中脯氨酸溶液的进样浓度为8.3140～203.3500μg/ml；

40、本发明采用浓度分别为7.9860μg/ml、9.9825μg/ml、19.9650μg/ml、39.9300μg/ml、99.8250μg/ml的丙氨酸溶液，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定，得到峰面积，以浓度(x，μg/ml)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标绘制响应曲线y＝15137.7776x-48353.7156，r2＝0.9994。因此，本发明中丙氨酸溶液的进样浓度为7.9860～199.6500μg/ml。

41、本发明采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对血余炭供试品的相似度进行评价，得到由7个特征峰构成的血余炭hplc标准特征图谱，与对照药材参照物色谱中的7个特征保留时间相对应，其中，峰3、峰4应分别与相应的对照品参照物峰的保留时间相对应；与丙氨酸对照品参照物峰相对应的峰为s峰，在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：0.45(峰1)、0.67(峰2：甘氨酸)、1.09(峰5)、1.65(峰6：缬氨酸)、1.85(峰7)。

42、本发明提供了一种血余炭药材、饮片、标准汤剂、中间体及其配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，采用上述技术方案所述的构建方法进行检测，分析检测结果。

43、本发明提供了一种血余炭高效液相特征图谱的构建方法，包括以下步骤：a)将血余炭原料采用盐酸水解，滤过，取滤液蒸干，残渣采用盐酸溶解，得到供试品溶液；b)将所述供试品溶液衍生化后采用高效液相色谱法测定，得到血余炭高效液相特征图谱；色谱条件包括：c18柱，流动相a为乙腈，流动相b为0.02％磷酸溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈-0.02％磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，以丙氨酸为参照物，建立了血余炭药材、饮片、标准汤剂、中间体及其配方颗粒特征图谱重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对血余炭药材、饮片、标准汤剂、中间体及其配方颗粒的质量进行控制。