可提高细胞裂解液中质粒DNA分离度的液相色谱检测方法及质粒DNA浓度的检测方法与流程

本发明涉及核酸分析，特别涉及一种可提高细胞裂解液中质粒dna分离度的液相色谱检测方法及质粒dna浓度的检测方法。

背景技术：

1、在质粒制备过程分析中因裂解液中杂质含量高，其分析最为困难。目前，通常采用离子交换色谱法对质粒进行分析：比如对质粒和杂质含量分析、质粒纯度测定；或是对质粒拓扑异构体分析。

2、质粒dna由核苷酸组成，在溶液中以阴离子形式存在，因而离子交换色谱法用于质粒分析时为阴离子交换色谱模式。根据质粒dna与染色体dna、蛋白、rna等阴离子杂质的电荷密度不同，阴离子交换色谱可用于质粒的分离。将质粒和蛋白、rna、gdna等杂质有效分离是色谱柱准确定量质粒的前提。

3、然而，质粒与蛋白质和低分子量rna的分离比较容易，与高分子量rna的分离却比较困难，特别是未经纯化的裂解液，因样品中高分子量rna含量很高，与质粒共洗脱形成宽峰，一般的色谱柱均无法实现分离。此外，在一些情况下，流动相会对质粒dna的出峰效果造成干扰，从而造成对质粒dna的含量检测结果误差较大。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种能大幅度地提高质粒与杂质(特别是高分子量rna、gdna等)的分离性能的方法，且能精确定量裂解液中的质粒dna的含量，不会出现由于流动相对待测的质粒dna的出峰造成影响，也不会对质粒dna的检测带来干扰，确保检测结果的准确度。

2、本发明的目的之一在于，提供一种可提高细胞裂解液中质粒dna分离度的液相色谱检测方法，其包括如下步骤：

3、步骤1：

4、样品的制备：用tris-hcl和盐酸胍溶液稀释并制备不同浓度的样品，制成不同浓度的样品溶液；

5、流动相a的制备：所述流动相a为tris-hcl溶液与盐酸胍的混合溶液；

6、流动相b的制备：所述流动相b为tris-hcl溶液、氯化钠与盐酸胍的混合溶液；

7、步骤2：色谱柱参数选定：色谱柱为阴离子交换色谱柱，采用梯度洗脱方法，流速为0.5-0.75ml/min，柱温30℃，检测波长为260nm；

8、步骤3：将步骤1的样品进行上机检测，并记录色谱图。本发明的流动相a和流动相b中均添加了盐酸胍，可以减少样品的基质干扰；利用本发明的流动相a和流动相b，并配合本发明的色谱柱参数的选择，经过实验验证，对质粒dna的出峰分离度佳，本发明能够将质粒dna与杂质完全分离，包括与蛋白，rna和gdna完全分离的目的，能够实现对细胞裂解液中质粒dna含量的准确测定，因而，为后续利用液相色谱的对质粒dna浓度的准确检测提供了基础。本发明通过在流动相中添加盐酸胍，不会在质粒dna的出峰位置形成干扰，因此，进一步实现了裂解液中质粒dna含量的准确测定。

9、进一步的，所述阴离子交换色谱柱为以单分散聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物微球基质，季铵基官能团的色谱柱。

10、更进一步的，所述阴离子交换色谱柱的规格为：柱长为50-200mm，色谱柱内径为2.0-5.0mm，单分散聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物微球基质的粒径为1-5μm。

11、更进一步的，所述色谱柱的柱长为100-200mm，色谱柱内径为2-5mm，粒径为3-8μm。例如，色谱柱的柱长为100mm、125mm、135mm、155mm、175mm或200mm；色谱柱的内径为2mm、2.5mm、3mm、3.8mm、4.5mm或5mm；单分散聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物微球基质的粒径为1μm、1.3μm、1.9μm、2.7μm、3.6μm、4.3μm或5μm。

12、更进一步的，所述色谱柱为nanochrom biocore sax，所述色谱柱的柱长为150mm，色谱柱的内径为4.6mm，单分散聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物微球基质的粒径为5μm。

13、更进一步的，所述流动相a的tris-hcl溶液浓度为0.01-0.05mol/l，盐酸胍浓度为0.2mol/l；流动相b中tris-hcl溶液的浓度为0.01-0.05mol/l，氯化钠浓度为0.5-1.5mol/l，盐酸胍浓度为0.2mol/l。

14、更进一步的，所述流动相a的tris-hcl溶液为0.02mol/l，盐酸胍浓度为0.2mol/l；流动相b的tris-hcl的浓度为0.02mmol/l，氯化钠浓度为1.0mol/l，盐酸胍浓度为0.2mol/l，所述流动相a和流动相b的ph范围为6.0-8.5。在同一检测实验中，流动相a和流动相b的ph相同。例如流动相a的ph为6.0，流动相b的ph也为6.0；流动相a的ph为7.5，流动相b的ph也为7.5。因此，通过将流动相a和流动相b的ph设置为相同的，可避免两个流动相的不同ph对质粒dna的性能带来不同的影响，而影响检测效果。

15、更进一步的，所述拖尾因子的范围为0.8-1.2。

16、更进一步的，所述液相色谱的理论塔板数不低于15000。

17、本发明的目的之二在于，提供一种细胞裂解液中质粒dna浓度的检测方法，采用上述的可提高细胞裂解液中质粒dna分离度的液相色谱检测方法对样品进行液相色谱检测，具体包括如下步骤：

18、步骤21：

19、标准曲线样品的制备：用tris-hcl和盐酸胍溶液稀释并制备不同浓度的样品，制成不同浓度的样品溶液；

20、待测样品的制备：用tris-hcl和盐酸胍溶液稀释并制备待测样品溶液；

21、流动相a的制备：所述流动相a为tris-盐酸与盐酸胍的混合溶液；

22、流动相b的制备：所述流动相b为tris-盐酸、氯化钠与盐酸胍的混合溶液；

23、步骤22：色谱柱参数选定：色谱柱为阴离子交换色谱柱，采用梯度洗脱方法，流速为0.5-0.75ml/min，柱温30℃，检测波长为260nm；

24、步骤23：质粒浓度标准曲线的制备：将步骤21的标准曲线样品进行上机检测，绘制标准曲线；

25、步骤24：将步骤21的待测样品进行上机检测，并根据步骤23的标准曲线计算待测样品的浓度。利用本发明的方法，通过将质粒dna与杂质完全分离，确保了液相色谱得到的结果的准确度，并利用外标法(通过标准品建立标准曲线)定量裂解液中质粒的浓度，从而实现了对细胞裂解液中质粒dna含量的准确测定，且质粒dna含量越高，对质粒dna含量的检测越稳定。上述检测方法可以确保在进行质粒dna检测时对待测样品的分离度高，且不会对质粒dna的出峰状态造成影响，检测结果准确而稳定，适用于规模化生产检测。

技术特征：

1.一种可提高细胞裂解液中质粒dna分离度的液相色谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的可提高细胞裂解液中质粒dna分离度的液相色谱检测方法，其特征在于，所述阴离子交换色谱柱为以单分散聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物微球基质，季铵基官能团的色谱柱。

3.根据权利要求2所述的可提高细胞裂解液中质粒dna分离度的液相色谱检测方法，其特征在于，所述阴离子交换色谱柱的规格为：柱长为50-200mm，色谱柱内径为2.0-5.0mm，单分散聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物微球基质的粒径为1-5μm。

4.根据权利要求3所述的可提高细胞裂解液中质粒dna分离度的液相色谱检测方法，其特征在于，所述色谱柱的柱长为100-200mm，色谱柱内径为2-5mm，单分散聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物微球基质的粒径为3-8μm。

5.根据权利要求4所述的可提高细胞裂解液中质粒dna分离度的液相色谱检测方法，其特征在于，所述色谱柱为nanochrom biocore sax，所述色谱柱的柱长为150mm，色谱柱的内径为4.6mm，单分散聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物微球基质的粒径为5μm。

6.根据权利要求1-5任一项所述的可提高细胞裂解液中质粒dna分离度相色谱检测方法，其特征在于，所述流动相a的tris-hcl的浓度为0.01-0.05mol/l，盐酸胍浓度为0.2mol/l；流动相b中tris-hcl的浓度为0.01-0.05mol/l，氯化钠浓度为0.5-1.5mol/l，盐酸胍浓度为0.2mol/l。

7.根据权利要求6所述的可提高细胞裂解液中质粒dna分离度的液相色谱检测方法，其特征在于：所述流动相a的tris-hcl溶液为0.02mol/l，盐酸胍浓度为0.2mol/l；流动相b的tris-hcl溶液的浓度为0.02mmol/l，氯化钠溶液浓度为1.0mol/l，盐酸胍浓度为0.2mol/l，所述流动相a和流动相b的ph范围为6.0-8.5。

8.根据权利要求1-5任一项所述的可提高细胞裂解液中质粒dna分离度的液相色谱检测方法，其特征在于，所述拖尾因子的范围为0.8-1.2。

9.根据权利要求1-5任一项所述的可提高细胞裂解液中质粒dna分离度的液相色谱检测方法，其特征在于，所述液相色谱的理论塔板数不低于15000。

10.一种细胞裂解液中质粒dna浓度的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-5、7-9中任一项所述的可提高细胞裂解液中质粒dna分离度的液相色谱检测方法对样品进行处理和进行液相色谱检测，具体包括如下步骤：

技术总结
本发明公开了一种可提高细胞裂解液中质粒DNA分离度的液相色谱检测方法及质粒DNA浓度的检测方法，本发明使用阴离子交换色谱柱，以Tris‑HCl‑氯化钠和盐酸胍的混合液为流动相，采用梯度洗脱方法；将配制好的分析溶液上机测定。本发明分析方法能够有效准确的将细胞裂解液中的质粒DNA与蛋白、RNA、gDNA分离，并利用外标法定量裂解液中质粒的浓度，从而保证对质粒DNA浓度的检测准确性。

技术研发人员：赵美玉,王德朋,周峰,唐斌,赵晓剑
受保护的技术使用者：苏州百因诺生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25