将超滤法结果换算成平衡透析法结果的游离激素检测方法与流程

本发明属于游离激素检测，具体地，涉及将超滤法结果换算成平衡透析法结果的游离激素检测方法。

背景技术：

1、在血液循环中，类固醇激素以结合态和游离态两种形式存在，其中，绝大部分可逆性的与血浆蛋白结合，仅极微量呈现游离状态。由于游离类固醇激素可以通过细胞膜进入靶组织细胞，与细胞内的受体结合，发挥其生物学作用，是类固醇激素发挥生理效应的真正活性部分，可以确切地反应人体真实的类固醇激素功能的指标。目前游离物质分离的主要方法为超滤法和平衡透析法。其中，平衡透析法是检测游离激素的金标准。

2、如中国专利申请公布号cn111398490a，发明名称为“质谱法检测游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素试剂盒”，公开的试剂盒包括：用于平衡透析分离结合态和游离态的三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂；又包括透析液；以及用于通过固相萃取从透析液中提取游离态的三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂；又包括内标溶液、平衡液、淋洗液和洗脱液。该方案的试剂盒检测时，利用平衡透析法将人血清中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素转移到透析液中，然后通过固相萃取方法将其从透析液中提取出来；通过超高效液相色谱进行分离后，进入质谱进行检测，利用与校准品的比较得到待测样品的浓度，保障了检测结果准确性。不同浓度的质控品保证了检测结果的可靠性。但平衡透析法所需的时间长，溶液体积会变化，且透析时间过长可能会发生蛋白渗漏现象，由此会造成游离物质比例的显著高估等缺点；存在药物与半渗透膜等试验装置的非特异性结合，可能造成游离药物浓度的低估，进而影响试验结果；存在donnan效应，带电粒子不通过半透膜而产生不均匀的电荷，使两侧粒子浓度不一致。尤其对于高离子化且低蛋白结合的化合物，该效应最为明显。

3、相较于平衡透析法，超滤法可以达到快速分析的要求，如中国专利申请公布号cn113390977a，发明名称为“一种同时测定唾液中游离甲状腺激素t3、rt3、t4和皮质醇的方法”，公开的方法通过超滤离心，并选取合适的截留分子量限制范围的滤膜，去除唾液中的蛋白和结合态的甲状腺激素、皮质醇，再以合适的比例加入甲醇等防吸附试剂，攻克了唾液中游离态t3、rt3、t4和皮质醇检测过程中存在的严重吸附问题。利用高效液相色谱串联质谱分析技术，一次同时精确检测唾液中的游离甲状腺激素t3、rt3、t4和皮质醇四种游离态激素。该方法具有高通量，操作简便，处理效率高，耗材成本低，准确度高和灵敏度高的优点。但超滤法在超滤过程中温度不容易受控制。由于游离的激素浓度随超滤或平衡透析的温度变化，而人体的体温为37℃，在37℃时游离的激素的浓度最能体现人的游离激素的水平及生理活性，而现有的超滤离心机无法快速稳定或难以达到37℃。

4、如上所述，平衡透析法耗时长，如血液中游离类固醇激素，一般需要在37℃恒温箱中孵育至少16 h，无法满足临床生物样品快速分析出结果的要求。且传统的平衡透析法由于透析液体积较少，当有些游离成分的含量较低时，即使富集也难以检出。而采用超滤法得出的超滤液体积更多，又由于超滤液浓度不受体积迁移的影响，在富集浓缩后，使检测限得以较大程度的改善，但存在着超滤过程中温度不易控制的缺点。

技术实现思路

1、1、要解决的问题

2、针对现有高效液相色谱-串联质谱技术检测游离类固醇激素前处理时，采用超滤法处理虽高效快速，但处理过程中温度不易控制，导致测定结果偏差较大，而采用平衡透析法虽测定结果更加精确，但耗时较长，无法满足临床生物样品快速分析结果的要求，本技术提供将超滤法结果换算成平衡透析法结果的游离激素检测方法，能够兼顾检测准确度高且耗时短的要求。

3、2、技术方案

4、为达到上述目的，提供的技术方案为：

5、本发明的将超滤法结果换算成平衡透析法结果的游离激素检测方法，包括以下步骤：

6、使用超滤法在x温度下从样品中分离所述游离激素，测定浓度，得到第一浓度数据uf cx；

7、使用平衡透析法在y温度下从所述样品中分离所述游离激素，测定浓度，得到第二浓度数据ed cy；

8、利用所述第一浓度数据uf cx和第二浓度数据ed cy得到比值系数 rx， rx=uf cx/ed cy；

9、利用比值系数 rx换算x温度下超滤法测定所述游离激素浓度uf cx成真实浓度 cr，所述 cr=uf cx/ rx。

10、进一步，所述x温度和所述y温度为同一温度。

11、进一步，所述x温度和所述y温度为不同温度。

12、进一步，所述x温度或y温度的范围为4~37℃。

13、进一步，所述x温度为4℃、10℃、20℃或30℃；所述y温度为37℃。

14、进一步，所述测定浓度的步骤使用的方法为高效液相色谱-串联质谱法。

15、进一步，所述游离激素为游离类固醇激素。

16、进一步，所述游离类固醇激素为游离睾酮、游离雄烯二酮、游离脱氢表雄酮、游离硫酸脱氢表雄酮、游离孕酮、游离17-羟孕酮中的任一种。

17、进一步，所述样品为血液、唾液或尿液。

18、进一步，所述样品为血清或血浆。

19、3、有益效果

20、采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：

21、本发明的将超滤法结果换算成平衡透析法结果的游离激素检测方法，通过超滤法从样品中分离游离激素，测得第一浓度数据，使用平衡透析法从样品中分离游离激素，测得第二浓度数据，利用第一浓度数据和第二浓度数据建立换算检测方法，对超滤法测得的数据进行换算，兼顾检测准确度高且耗时短的要求。实现在常规温度条件下超滤就可测出样品中游离激素的真实浓度，方法操作简单，不受样品稀释和体积迁移的影响。

22、本发明的将超滤法结果换算成平衡透析法结果的游离激素检测方法，运用超滤法可以快速的分析血清中游离激素，得到的超滤液也远比平衡透析液多，可降低分析浓度的检测限。

23、本发明的将超滤法结果换算成平衡透析法结果的游离激素检测方法，可实现常规温度条件超滤（如4℃、室温等）检测结果换算成37℃理论游离激素浓度，使温度易于受控，不受体积迁移的影响，使检测结果更可靠。

24、本发明的将超滤法结果换算成平衡透析法结果的游离激素检测方法，利用超滤法结合lc-ms/ms测量游离激素，传统的平衡透析方法由于透析液体积较少，当有些待测物的游离浓度较低时，即使富集也无法检出，而采用超滤法得出的超滤液体积会更多，而且超滤液浓度不受体积迁移的影响，在富集浓缩后是的检测限得以较大程度的改善。