一种基于CHA的荧光适配体传感器、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及分析检测，具体涉及一种基于无酶催化发夹自组装（cha）的荧光适配体传感器、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、液态奶容易受到微生物污染从而影响其产品品质，特别是黄曲霉毒素m1（afm1）污染，黄曲霉毒素m1（afm1）污染不仅会导致乳制品霉败变质，营养物质损失，降低乳质量，还会对人和动物机体内dna、rna、蛋白质和各种酶类的合成有一定的抑制作用，同时会损害肝脏、肾脏、神经等组织器官，造成不同程度的直接或间接危害，因此，需要对黄曲霉毒素m1（afm1）进行检测，近年来，传统检测黄曲霉毒素的方法有薄层色谱法、质谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等技术，这些技术都存在成本高、耗时长、操作复杂、灵敏度差等不足，因此，需要研发一种现场快速高灵敏检测低含量的黄曲霉毒素m1（afm1）的方法，以保障液态奶食品安全和产品品质。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本发明第一个目的是提供一种基于无酶催化发夹自组装（cha）的荧光适配体传感器，包括靶标识别装置（p1-apt）、信号放大装置和碳点（cds）；

2、所述靶标识别装置包括黄曲霉毒素m1适配体apt以及与其部分互补的触发链p1-dna；

3、所述信号放大装置包括发夹dna探针1（hp1）和辅助发夹dna探针2（hp2）；发夹dna探针1（hp1）含有c-ag+-c结构；

4、当检测体系中存在黄曲霉毒素m1（afm1）时，促发靶标识别装置（p1-apt）和信号放大装置，发生无酶催化发夹自组装（cha），ag+被释放，进而与碳点（cds）发生光致电子转移，使得碳点（cds）发生明显荧光猝灭。

5、而且，所述黄曲霉毒素m1适配体apt的基因序列如seq id no.1所示；

6、所述触发链p1-dna的基因序列如seq id no.2所示；

7、所述发夹dna探针1（hp1）的基因序列如seq id no.3所示；

8、所述辅助发夹dna探针2（hp2）的基因序列如seq id no.4所示。

9、而且，所述发夹dna探针1（hp1）和辅助发夹dna探针2（hp2）的浓度为300nm；p1-dna的浓度为1μm；apt的浓度为1μm。

10、而且，所述发夹dna探针1（hp1）的制备方法如下：将发夹dna探针1（hp1）所用dna链溶液（10μm）与硝酸银溶液（50μm）按照最终浓度比为1:6加入到添加了硝酸钠和硝酸镁的mops缓冲液中，混合均匀并室温静置孵育60min制得含有c-ag+-c的发夹dna探针1（hp1）。

11、而且，所述靶标识别装置（p1-apt）的制备方法如下：将10μm50μl的p1-dna和10μm50μl的afm1黄曲霉毒素m1适配体apt混合在400μl添加了硝酸钠和硝酸镁的mops缓冲液中，室温静置孵育30min以形成靶标识别装置（p1-apt）双链dna结构。

12、而且，所述mops缓冲液的浓度为10mm，ph为7.0，其中添加了100mm硝酸钠、2.5mm硝酸镁。

13、而且，所述碳点（cds）的制备方法如下：

14、s1、将5ml甲酰胺和20ml乙醇混合形成澄清溶液，然后将其转移到衬有聚四氟乙烯的反应釜中；

15、s2、将反应釜置于烘箱中于220℃下保持12h，反应结束冷却4h；

16、s3、将所得溶液用透析膜透析48h，随后，用0.22μm膜滤器过滤除去不溶物，然后冷冻干燥。

17、如图1所示，本发明提供的一种基于无酶催化发夹自组装（cha）的荧光适配体传感器的反应原理如下：当检测反应体系中无黄曲霉毒素m1（afm1）存在时，将无法引起cha组装反应的进行，配体apt和触发链p1-dna组成的双链将会稳定存在于溶液中，触发链p1-dna无法释放，就不会触发cha开关组装反应的进行，同时发夹dna探针1（hp1）和辅助发夹dna探针2（hp2）开关将不会被打开，发夹dna探针1（hp1）和辅助发夹dna探针2（hp2）不能发生互补反应。当体系中存在黄曲霉毒素m1（afm1）时，由于黄曲霉毒素m1（afm1）与黄曲霉毒素m1适配体apt结合的亲和力远远大于黄曲霉毒素m1适配体apt与触发链pi-dna之间简单的作用力，所以黄曲霉毒素m1（afm1）会优先与黄曲霉毒素m1适配体apt结合，形成稳定的afm1-apt复合物，之后会释放被置换出来的触发链p1-dna。发夹dna探针1（hp1）将会被自由状态下的触发链p1-dna打开，并且互补配对。同时ag+将从发夹dna探针1（hp1）的c-ag+-c结构中被释放出来，被打开的发夹dna探针1（hp1）又将会与反应体系中的辅助发夹dna探针2（hp2）的碱基结合，形成hp1/hp2双链dna结构，以引发基于cha的循环扩增，而最终触发链p1-dna将会被释放出来继续参与到又一轮cha的循环中，通过不断地循环实现反应的信号放大，而hp1/hp2双链dna结构将会在体系中积累。重要的是在整个反应中，发夹dna探针1（hp1）的c-ag+-c结构会被打开释放ag+，且随着循环反应的进行ag+的释放不断地增加，而大量释放的游离ag+将作为猝灭剂，使得碳点（cds）的荧光猝灭，从而实现黄曲霉毒素m1（afm1）的定量检测。

18、本发明用于牛奶中黄曲霉毒素m1（afm1）检测。

19、本发明第三个目的是一种用于黄曲霉毒素m1（afm1）检测的试剂盒包括试剂a：p1-apt溶液、试剂b：发夹dna探针1溶液、试剂c：辅助发夹dna探针2溶液、试剂d：cds溶液、微型反应瓶a，微型温度孵育器、荧光读数仪、微型石英比色皿；使用方法如下：将试剂b加入到微型反应瓶a中，接着加入试剂a和c，混匀放入微型温度孵育器于35℃下共孵育60min，再加入试剂d混匀并转移到微型石英比色皿，然后放入荧光读数仪，设置激发波长330nm，测定并记录376nm的荧光强度。

20、而且，所述a-d试剂的浓度分别为，a：1μm、b：300nm、c：300nm、d：0.1mg/ml。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

22、1、本发明为了满足液态奶中黄曲霉毒素m1（afm1）低含量时的高灵敏检测，采用碳点（cds）作为荧光信号分子，利用cha循环反应进一步放大荧光信号，该传感器现实可行。

23、2、本发明通过引入等温扩增技术，荧光适配体传感器的灵敏度可以得到显著提高，进而增强其在生物传感和纳米医学中的应用潜力，等温扩增技术的操作简单，因此在传感器设计和实际应用中具有较高的可操作性，此外，该技术的信号放大效果也使得传感器能够检测到低浓度的目标物质，提高了检测的灵敏度和准确性。

24、3、本发明构建一种基于无酶催化发夹自组装（cha）的荧光适配体传感器，在35℃孵育60min，可以完成高灵敏、特异性检测黄曲霉毒素m1（afm1），检测线性范围为0.1~50ng/ml，检测限为0.1ng/ml，满足国标对乳中afm1限量0.5μg/kg(即0.4ng/ml）的检测；在接种黄曲霉毒素m1（afm1）（1、5、10ng/ml）的牛奶样品检测中，检测回收率分别为99.0%、97.2%和109.5%，rsds低于3%，精密度达到可接受水平。