一种动物血清样本常温保存液的配制及其应用的制作方法

本发明属于生物技术应用，具体涉及一种动物血清样本常温保存液的配制及其应用。

背景技术：

1、动物的检验检疫技术中使用较多的检测方法是elisa检测，该技术均以动物血清样本作为检测对象。动物血清样本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以hrp为标记的elisa测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。动物血清样本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性hrp，也会产生假阳性反应。一般说来，在5天内测定的动物血清样本可放置于4℃，样本在冰箱中保存时间过长导致血清igg聚合，使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需-20℃保存，冻结动物血清样本融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡，混浊或有沉淀的动物血清样本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的动物血清样本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。常规保存血清样本，自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。

2、动物血清样本的检测应用，需要一种在室温下可以长期保存的血清样本保存液。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种动物血清样本常温保存液的配制及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种动物血清样本常温保存液的配制及其应用，样本保存液包括：生物缓冲液、海藻糖3-10％、甘油25-75％、bsa 0.1-1.5％、生物抗氧化剂0.1-1.0％、水解蛋白肽(小分子)0.15-3.0％、防腐剂krovin 300m 0.05-0.1％。其中，所述生物缓冲液为10mm pbs缓冲液(ph7.2-7.4)或20mm tris-hcl缓冲液(ph7.4)，海藻糖为d-(+)-海藻糖二水合物，甘油、bsa、生物抗氧化剂、水解蛋白肽(小分子)、防腐剂krovin 300m，各成分依据质量比进行配制，使用时定量稀释动物血清样本。

3、进一步而言，所述样本保存液包括：生物缓冲液、海藻糖3-10％、甘油25-75％、bsa0.1-1.5％、生物抗氧化剂0.1-1.0％、水解蛋白肽(小分子)0.15-3.0％、防腐剂krovin300m 0.05-0.1％。其中，所述生物缓冲液为10mm pbs缓冲液(ph7.2-7.4)或20mm tris-hcl缓冲液(ph7.4)，为其中之一。

4、进一步而言，所述样本保存液包括：生物缓冲液、海藻糖3-10％、甘油25-75％、bsa0.1-1.5％、生物抗氧化剂0.1-1.0％、水解蛋白肽(小分子)0.15-3.0％、防腐剂krovin300m 0.05-0.1％。其中，所述生物抗氧化剂为维生素c、维生素e、谷胱甘肽、过氧化物歧化酶sod、过氧化物酶pod、过氧化氢酶cat，至少使用其中的一种或二种以上。

5、进一步而言，所述样本保存液包括：生物缓冲液、海藻糖3％、甘油65％、bsa0.5％、生物抗氧化剂0.1％、水解蛋白肽(小分子)

6、0.15％、防腐剂krovin 300m 0.05％。其中，所述生物缓冲液为10mm pbs缓冲液(ph7.2-7.4)，所述的生物抗氧化物为过氧化物酶，用于防止蛋白质样本氧化变性，所述的海藻糖、bsa、生物抗氧化剂、水解蛋白肽(小分子)浓度为质量比，所述的甘油、防腐剂krovin300m的浓度为体积比。

7、进一步而言，所述样本保存液包括：生物缓冲液、海藻糖3％、甘油65％、bsa0.5％、生物抗氧化剂0.1％、水解蛋白肽(小分子)

8、0.15％、防腐剂krovin 300m 0.05％。其中，所述生物缓冲液为20mm tris-hcl缓冲液(ph7.4)，所述的生物抗氧化物为过氧化物酶，用于防止蛋白质样本氧化变性，所述的海藻糖、bsa、生物抗氧化剂、水解蛋白肽(小分子)浓度为质量比，所述的甘油、防腐剂krovin300m的浓度为体积比。

9、进一步而言，包括以下步骤：在生物缓冲液中加入海藻糖3-10％、bsa 0.1-1.5％、生物抗氧化剂0.1-1.0％、水解蛋白肽(小分子)0.15-3.0％等固体化学试剂，使其充分溶解，如有不溶性颗粒，应该过滤去除，继而量取液体试剂加入，如：甘油25-75％与防腐剂krovin 300m 0.05-0.1％。充分混匀，即为动物血清样本保存液。

10、进一步而言，在生物缓冲液中加入海藻糖3％、bsa 0.5％、生物抗氧化剂0.1％、水解蛋白肽(小分子)0.15％等固体化学试剂，使其充分溶解，如有不溶性颗粒，应该过滤去除，继而量取液体试剂加入，如：甘油65％与防腐剂krovin 300m 0.05％。充分混匀，即为动物血清样本保存液。所述的生物缓冲液为10mm pbs缓冲液(ph7.2-7.4)。

11、进一步而言，在生物缓冲液中加入海藻糖3％、bsa 0.5％、生物抗氧化剂0.1％、水解蛋白肽(小分子)0.15％等固体化学试剂，使其充分溶解，如有不溶性颗粒，应该过滤去除，继而量取液体试剂加入，如：甘油65％与防腐剂krovin 300m 0.05％。充分混匀，即为动物血清样本保存液。所述生物缓冲液为20mm tris-hcl缓冲液(ph7.4)。

12、进一步而言，生物缓冲液、海藻糖、甘油、bsa、生物抗氧化剂、水解蛋白肽(小分子)、防腐剂krovin 300m。以上化合物成分组成的复合保存液具有以下特点：1.有效地抑制微生物的生长，避免血清样本由于微生物生长消耗蛋白质造成目标物(如抗原/抗体)的降解；2.含有甘油的抗冻成分，避免血清样本处于低温环境时形成冰晶破坏蛋白质的三维结构，从而有效地保护目标物(如抗原/抗体)的生物活性；3.保存液中加入了生物抗氧化剂，避免目标蛋白(如抗体/抗原)中氨基酸侧链基团被氧化而变性；4.bsa与水解蛋白肽(小分子)作为目标蛋白(如抗原/抗体)的分子伴侣，可以有效地防止目标蛋白(如抗原/抗体)的水解或酶的降解。故，动物血清样本加入保存液后，血清样本可在室温下长期保存，保存期可以达到2年以上。

13、本发明的有益技术效果：

14、本发明的动物血清样本常温保存液，可以克服动物血清样本在采集时细菌污染等不利的问题，可以保证动物血清样本的质量。

15、在动物血清样本采集时用本保存液定量稀释血清样本，对样本的保存与应用带来意想不到的好处：

16、1)纠正样本采集时出现的轻微溶血对检测带来的不利影响。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以hrp为标记酶的elisa测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的hrp底物反应显色。

17、2)抑制样本采集及血清分离时带入的细菌，污染样本。一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。

18、3)克服动物血清样本的保存对温度的依赖。利用本发明的保存液配制的血清样本可以在常温下保存，保存于2-8℃也可以长期保存，保存期超过2年以上。

19、4)本保存液不仅可以防止目标蛋白氧化，保持目标蛋白自然活性，而且避免样本的反复冻融所产生的机械剪切力将对样本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。