一种测定适配体与蛋白质结合常数的毛细管电泳方法

本发明属于生物，具体涉及一种测定适配体与蛋白质结合常数的毛细管电泳方法。

背景技术：

1、目前，用于适配体和蛋白质相互作用分析的研究方法有荧光光谱法、表面等离子体共振法、核磁共振法和圆二色谱法等，但这些方法存在操作步骤繁琐、成本较高、需要固定或标记配体、无法自动化和适用范围有限等问题。1996年williams和vigh提出了一种快速测定有效电泳迁移率的方法，在毛细管的恒温区实现电渗流和样品电泳迁移率的快速、准确测定。压力驱动亲和毛细管电泳法具有诸多优点，包括样品消耗少、容易自动化、分析时间短、分离效率高和重现性和准确性好，且无须对目标分子进行衍生化或固定化，有效避免由于分子结构改变而导致的系统误差。近年来，该方法已被广泛用于涂层毛细管电泳、非水毛细管电泳的电渗流测定，以及生物大分子与药物分子、生物大分子间结合常数的测定等领域。然而，该方法中所使用的中性标记物多为有机物，这对适配体会产生疏水作用，进而影响其与蛋白靶标的结合，导致结合常数的测定不准确。另外，由于缓冲液中添加了蛋白靶标，引起了粘度的变化，若不进行粘度校正，所得到的结合常数也存在不准确的问题。

2、细胞色素c是位于线粒体膜间隙的血红素蛋白，可作为细胞凋亡的一种标志物，同时它也是一种碱性蛋白，易与带负电的核酸结合。2002年，chinnapen课题组筛选出第一条61mer，与细胞色素c结合的检测限达到微摩尔级，还发现了另外两条适配体(apt 40和apt76)。利用三条核酸适配体与细胞色素c间相互作用的研究，可以确定其亲和力以及分析为未来适配体用于药物研发提供理论依据。但目前关于三条核酸适配体与细胞色素c间结合的方法研究仍然缺失。

技术实现思路

1、解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种测定适配体与蛋白质结合常数的毛细管电泳方法，通过以药物分子可的松作为中性标记物，在电泳缓冲液中加入不同浓度的细胞色素c，并构建合适的分离条件，通过粘度校正的方法来精确表征适配体的有效电泳迁移率差异，并准确测定了适配体与细胞色素c的结合常数。该方法消除了毛细管内温度不均一对迁移率的影响，减小了高电压下缓冲液电解质解离现象的发生，选用药物分子作为中性标记物，降低了常见有机中性标记物对适配体疏水作用的影响。本发明测定细胞色素c与适配体结合常数方法操作简单、测定速度快且准确性好。

2、技术方案：一种测定适配体与蛋白质结合常数的毛细管电泳方法，包括以下步骤：

3、1)溶液配制：将适配体和中性标记物加到缓冲液中混合均匀，得到待测溶液；将中性标记物加到缓冲液中混合均匀，得到对照溶液；将不同浓度的细胞色素c加到缓冲液中混合均匀，得到一系列电泳缓冲液；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼砂缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液或tris-hac缓冲液中的一种，所述适配体为apt61，其核苷酸序列如seq id no:1所示：

4、seq id no:1：

5、agtgtgaaatatctaaactaaatgtggagggtgggacgggaagaagtttatttttcacact；

6、2)毛细管电泳仪的预处理：羟丙基纤维素涂覆的毛细管在使用前用电泳缓冲液冲洗，再将毛细管中充满电泳缓冲液，备用；

7、3)进样检测：第一次进样的样品为待测溶液，第二次进样的样品为对照溶液，测定待测溶液在一系列电泳缓冲液中的有效电泳迁移率μaep，工作站上出现三个峰，分别记为峰1、峰2和峰3，其中峰1对应的时间为第一次进样中适配体的出峰时间tr，峰2对应的时间为第一次进样中中性标记物的出峰时间tn1，峰3为第二次进样中中性标记物的出峰时间tn2；

8、4)有效电泳迁移率的计算：根据第二次进样的中性标记物的出峰时间tn2、第一次进样时间tinj和毛细管的有效长度le，计算气压推动速度vm，如下式(1)所示：

9、

10、式中：td是实验数据获取的时间延迟，

11、峰1和峰2之间的距离为待测溶液中适配体的有效迁移距离la，根据峰1和峰2的出峰时间差tn1-tr和气压推动速度vm，计算出la，如下式(2)所示：

12、

13、待测溶液中适配体的有效电泳迁移率μaep的计算公式如下式(3)所示：

14、

15、式中：lt为毛细管总长，v为分离电压，tran-up是分离开始时电压从0升到设定数值的时间，tran-down是分离结束时电压从设定数值降到0的时间；

16、5)粘度校正：考虑到含有不同浓度细胞色素c的电泳缓冲液，其溶液粘度的变化会对分析物的净迁移率产生影响，该步骤通过在毛细管中注入中性标记物，并用恒定的压力推动其通过毛细管，通过测定中性标记物在一系列电泳缓冲液中的保留时间，代入下式(4)来对净迁移率进行粘度校正，

17、

18、其中，t0为中性标记物在缓冲液中的保留时间，t为中性标记物在一系列电泳缓冲液中的保留时间，为适配体的粘度校正后的净迁移率；

19、6)结合常数的计算：根据下式(5)，以对[c]进行非线性拟合，得到结合常数k：

20、

21、其中，[c]为电泳缓冲液中细胞色素c的浓度，为适配体的粘度校正后净迁移率，μep，a为适配体的净迁移率，μep，ac为适配体与细胞色素c结合的复合物的净迁移率，μep，a和μep，ac均为常数。

22、优选的，所述待测溶液中适配体的浓度为8-15μmol/l。

23、优选的，所述缓冲液的浓度为10～50mmol/l，ph为6～9。

24、优选的，所述中性标记物为可的松。

25、优选的，所述电泳缓冲液中细胞色素c的浓度为0～14μmol/l。

26、优选的，步骤3)的具体过程为：第一次进样：采用1psi进样压力5s进样的方法向毛细管中进样；分离：将毛细管进样端插入缓冲液槽，施加0.8psi的压力15s，将待测溶液推入到毛细管位于毛细管电泳仪设备的恒温区，向毛细管两端施加-5kv的分离电压1～2min，使待测溶液向检测窗口迁移，但不能经过检测窗口；第二次进样：采用与第一次进样相同的方法向毛细管中进样，且对照溶液中中性标记物的浓度与待测溶液中中性标记物的浓度相同；检测：将毛细管进样端插入缓冲液槽，施加0.8psi压力，将两次进样的样品推向毛细管的检测窗口，工作站上出现三个峰，记录三个峰的出峰时间。

27、优选的，步骤3)中毛细管电泳参数为：进样压力为1.0psi，进样时间为5.0s，分离电压为-5kv，检测波长为260nm，柱温为25℃；每次进样前，使用含有相应浓度细胞素色素c的电泳缓冲液以10.0psi的压力冲洗毛细管5min。

28、优选的，步骤5)中毛细管电泳参数为：中性标记物为200μmol/l可的松，进样压力为1.0psi，进样时间为5.0s，推动压力为1.5psi，检测时间为5min，检测波长为260nm，柱温为25℃；每次进样前，使用含有相同浓度细胞素色素c的电泳缓冲液以压力10.0psi冲洗毛细管3min。

29、有益效果：本发明一种测定适配体与蛋白质结合常数的毛细管电泳方法，以药物分子可的松作为中性标记物，并构建合适的毛细管电泳分离条件。该方法有效地克服了现有技术中分析时间长且确定的迁移率不准确等问题，通过缩短分离时间，以及粘度校正的方法来提高分析物的有效迁移率检测的准确性，并进一步确定结合常数。本发明的方法由于分析时间短，可有效消除毛细管内温度不均一对迁移率的影响，且较低的分离电压可有效缓解电泳缓冲液中电解质的解离。选用药物分子可的松代替常用的甲醇和二甲亚砜作为中性标记物，可避免对适配体疏水作用的影响。本发明准确测定了适配体在不同浓度细胞色素c中的有效电泳迁移率，并确定了二者结合常数，该方法操作简单、分析时间短且准确性好。本发明也可用于其他蛋白质靶标与适配体间相互作用，并有望延伸应用于不同主客体间相互作用的研究。