一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生化试剂测定，特别涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒，还涉及所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒制备方法和应用。

背景技术：

1、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)是lipocalin的一种，最初是在激活中性粒细胞中被发现的一种小分子量分泌性蛋白，现代研究表明，ngal是诊断急性肾损伤的最有效生物学标志之一，也是早期糖尿病肾病的有效标志物之一。

2、1、急性肾脏病变的早期标志物

3、实验发现，在缺血肾脏发生的极早期(2h内)即可在血、尿中检测到ngal明显上调，对缺血-再灌注模型小鼠注射重组ngal，可减少氮质血症，减轻肾脏损伤。人体研究也发现心脏术后患者在急性肾脏病发生的2h内，血、尿ngal显著升高，据此，研究者推测ngal可作为心脏术后急性肾脏病的早期标志物。

4、2、慢性肾脏病的早期标志物

5、随着对多囊肾、iga肾病、原发性肾小球肾炎等病理类型的研究，发现尿ngal能评估疾病的严重程度及疗效，可预测早期慢性肾脏病的发生并准确预估疾病严重程度，有可能作为慢性肾脏病的早期标志物。

6、3、糖尿病肾病的早期标志物

7、实验发现，人体检测中，ngal与肥胖、高脂血症、高血糖、胰岛素抵抗呈正相关，与高密度脂蛋白的水平呈负相关。推测尿ngal可用于肾小管重吸收受损的肾病，还可评估损伤程度及治疗效果。

8、目前检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的方法有胶乳免疫比浊法、双抗夹心免疫化学发光法(ilma)、胶体金比色法。双抗夹心免疫化学发光法(ilma)，准确性和灵敏度高，但是仪器设备昂贵，试剂保存不方便，价格高；胶体金比色法，操作简单，出结果快，但是只能定性研究，无法定量。胶乳免疫比浊法具有特异性高，操作简单快捷、准确安全、可自动化分析、成本较低的优点，但现有技术中国产试剂盒存在分析灵敏度低，稳定性差，无法抗冷冻，容易受乳糜微粒(cm)影响等缺点，本发明针对现有中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白试剂盒的缺点进行改进以满足临床检测以及化学分析的要求。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒是一种稳定性强，灵敏度高，线性好，成本低的液体试剂盒。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒，试剂盒含有试剂r1和试剂r2；

4、试剂r1中含有以下成分：

5、

6、试剂r2中含有以下成分：

7、

8、其中所述百分比为体积比。

9、优选地，所述试剂r1的ph为7.5-8.0。

10、优选地，所述试剂r2的ph为6.5-7.5。

11、优选地，所述试剂r1和r2试剂中的表面活性剂选自吐温-20、曲拉通x-100、四乙二醇单硬脂酸酯、二乙二醇脂肪酸酯中的一种或多种。更优选地，表面活性剂为吐温-20、四乙二醇单硬脂酸酯、二乙二醇脂肪酸酯。

12、优选地，所述试剂r2试剂中的防冻剂为甘油、乙醇、四乙二醇单硬脂酸酯、三乙醇胺中的一种或多种。更优选地，防冻剂由四乙二醇单硬脂酸酯、三乙醇胺组成。

13、优选地，所述试剂r1和r2试剂中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、mit和苯甲酸钠中的一种或多种。更优选地，防腐剂为proclin300。

14、优选地，所述试剂r1与试剂r2的体积比为1～5:1。更优选地，所述试剂r1与试剂r2的体积比为4:1。

15、上述所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：兔抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体包被胶乳微球的制备方法为：取适量表面羧基化的聚苯乙烯胶乳微球，加入到10ml缓冲液中，使胶乳微球终浓度为1.0％；然后加入适量兔抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)及n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，室温下混合搅拌3小时左右，加入1ml 10g/l的bsa溶液，12000rpm离心40分钟，去除上清，所得沉淀即为兔抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体包被胶乳微球。再按照比例加入其它物质溶解，制成中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒。

16、本发明还公开了中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的浓度。

17、本发明试剂盒采用胶乳免疫比浊法，其反应原理为样本中的ngal可与吸附在胶乳微球上的抗ngal抗体产生抗原抗体的凝集反应，形成免疫复合物，通过测定该免疫复合物吸光度的变化，可算出样本中ngal的含量。反应具有特异性，使用全自动生化仪进行检测，操作简单、自动化程度高，可减少人为误差，适合大多数临床实验室应用。

18、有益效果

19、1)本发明稳定的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒为液体双试剂，无需复溶配制，开瓶可以直接使用。

20、2)通过在试剂r2中加入三乙醇胺、四乙二醇单硬脂酸酯组成复合防冻剂，三乙醇胺不但有封闭胶乳微球的作用，还能与四乙二醇单硬脂酸酯提高被抗体包被的胶乳微球的分散能力，有效地提高了试剂抗冷冻性能，方便试剂在低温下运输，有利于该试剂在市场中进一步的推广。

21、3)碳酸氢钠和二乙二醇脂肪酸酯共同作用，与乳糜微粒形成聚合物，可以有效分散和掩蔽乳糜微粒，避免干扰，大大增强试剂的抗干扰能力，一定程度的提高了试剂的稳定性。

22、4)该试剂的准确度、重复性、分析灵敏度、线性范围、稳定性等性能指标卓越，价格便宜，使用方便，有利于该试剂在市场中进一步推广。

技术特征：

1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒，其特征在于，试剂盒含有试剂r1和试剂r2；

2.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述试剂r1和试剂r2的缓冲液体系为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、n-氨基甲酰甲基乙磺酸缓冲液、2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲液中的一种。

3.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述试剂r1的ph为7.5-8.0，试剂r2的ph为6.5-7.5。

4.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述试剂r1和r2试剂中的表面活性剂选自吐温-20、曲拉通x-100、四乙二醇单硬脂酸酯、二乙二醇脂肪酸酯中的一种或两种。

5.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述试剂r2试剂中的防冻剂选自乙醇、四乙二醇单硬脂酸酯、三乙醇胺中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述试剂r1和r2试剂中的防腐剂选自叠氮钠、proclin300、mit和苯甲酸钠中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂r1与试剂r2的体积比为1～5:1。

8.一种权利要求1-7之一所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：先制成兔抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体包被胶乳微球，制备方法为：取适量表面羧基化的聚苯乙烯胶乳微球，加入到10ml缓冲液中，使胶乳微球终浓度为1.0％；然后加入适量兔抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及n-羟基丁二酰亚胺，室温下混合搅拌3小时，加入1ml 10g/l的bsa溶液，12000rpm离心40分钟，去除上清，所得沉淀即为兔抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体包被胶乳微球；再按照比例加入其它物质溶解，制成中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒。

9.一种权利要求1-7之一所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的浓度。

技术总结
本发明提供一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；试剂R1中含有以下成分：三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液、NaCl、碳酸氢钠、PEG6000、表面活性剂、防腐剂。试剂R2：2‑(N‑吗啉代)乙磺酸缓冲液、兔抗人NGAL抗体包被胶乳微球、防冻剂、防腐剂。本发明同时提供了该试剂盒的制备方法和应用，该试剂盒可以有效避免乳糜微粒的干扰，同时采用新型防冻剂组合，可以有效提高试剂的抗冷冻性，是一种稳定性强，灵敏度高，线性性好，成本低的液体试剂盒。

技术研发人员：胡书祥,高春蕾,刘安娜
受保护的技术使用者：中拓生物有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29